Nhiều nghiên cứu về hệ tiểu phân nano đã đề cập đến các thiết bị thử độ hòa tan đối với hệ tiểu phân nano, nhưng lựa chọn thiết bị nào thích hợp vẫn là vấn đề chưa rõ ràng. Theo Hang D. và cộng sự, nhược điểm của thiết bị hòa tan kiểu cánh khuấy là tốc độ hòa tan tại một số thời điểm ban đầu có thể chậm do tiểu phân nano chưa thấm và nổi trên bề mặt môi trường hòa tan, mặc dù trong môi trường hòa tan và bản thân trong hệ tiểu phân nano đã có chất diện hoạt. Tiểu phân có kích thước lớn hơn có đặc tính thấm tốt hơn, do đó, độ hòa tan của nguyên liệu có sự đồng đều về mức độ hòa tan giữa các lần thử nghiệm cao hơn so với tiểu phân nano. Sự khác nhau về độ hòa tan của tiểu phân nano do mức độ kết tụ khác nhau và tính thấm kém do diện tích bề mặt giảm [36]. Đồng thời, quá trình phun sấy hỗn dịch nano cũng có thể gây hiện tượng kết tụ tiểu phân nano, làm chậm tốc độ hòa tan trong giai đoạn đầu [17]. Với thiết bị hòa tan kiểu giỏ quay, đồ thị hòa tan có tốc độ hòa tan lớn trong những khoảng thời gian đầu do toàn bộ hệ tiểu phân được nhúng chìm vào môi trường thử độ hòa tan và giảm dần trong giai đoạn sau. Riêng đối với thiết bị hòa tan kiểu dòng chảy, hệ tiểu phân được đặt lên giá mang, hạn chế các vấn đề về khả năng thấm ướt đối với môi trường hòa tan. Khi đó, đồ thị hòa tan gần giống như đồ thị mô tả theo phương trình Noyes-Whitney [36].
Đối với hệ tiểu phân nano curcumin, theo một số nghiên cứu đã công bố, độ hòa tan được đánh giá bằng thiết bị cánh khuấy. Để khắc phục nhược điểm của thiết bị thử độ hòa tan này như đã phân tích ở trên, nghiên cứu của luận án tiến hành phân tán curcumin hoặc bột phun sấy chứa nano curcumin vào môi trường hòa tan trước khi thử độ hòa tan bằng cách siêu âm trong 3-4 giây. Phương pháp này cũng phù hợp với phương pháp thử độ hòa tan đối với hệ tiểu phân nano trong một số nghiên cứu [17], [21].
Về môi trường thử độ hòa tan, curcumin là dược chất sơ nước, khó phân tán vào môi trường nước, có thể bị kết tụ. Vì vậy, môi trường thử độ hòa tan được phối hợp thêm chất diện hoạt nhằm đảm bảo điều kiện “sink”, đồng thời tránh bám dính tiểu phân vào thành cốc thử. Natri laurylsulfat là chất diện hoạt thường được sử dụng thêm vào môi trường thử độ hòa tan curcumin. Tuy nhiên, tá dược này có tính kiềm ảnh hưởng đến độ ổn định của curcumin. Vì vậy, nghiên cứu lựa chọn chất diện hoạt Tween 80 thêm vào môi trường thử độ hòa tan với nồng độ 0,2%.
Sau khi lựa chọn thiết bị thử và môi trường thử độ hòa tan, một số điều kiện thử độ hòa tan được thay đổi cho phù hợp. Tốc độ khuấy đặt 100 vòng/phút để đảm bảo tiểu phân không bị bám dính thành cốc và vào cánh khuấy. Khó khăn lớn nhất là xác định được độ hòa tan ở những phút đầu tiên do các thời điểm lấy mẫu khá gần nhau. Để loại các tiểu phân dược chất không tan từ mẫu, hai phương pháp thông thường được sử dụng là lọc và ly tâm. Một số tác giả lấy mẫu từ môi trường hòa tan và tiến hành lọc qua màng lọc cellulose acetat kích thước lỗ lọc 0,2 hoặc 0,45 µm và định lượng curcumin. Tuy nhiên, mỗi lần mẫu được lấy ra lại kéo theo một lượng tiểu phân chưa hòa tan trong môi trường thử. Đồng thời, khi tiến hành lọc, phân tử dược chất kỵ nước có thể dễ dàng tương tác với màng lọc. Những vấn đề này có thể làm ảnh hưởng đến kết quả thử độ hòa tan. Do đó, phương pháp ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút được sử dụng để tách loại tiểu phân. Phương pháp này cũng phù hợp với một số phương pháp mô tả trong nghiên cứu thử độ hòa tan của hệ tiểu phân nano [56]. Để đảm bảo phần cắn không bị mất đi, toàn bộ phần cắn và dịch lọc rót trở lại môi trường hòa tan.
Kết quả đánh giá độ hòa tan ở mục 3.4.3.9 cho thấy: tốc độ hòa tan tăng nhanh đặc biệt trong 10 phút đầu do sự có mặt của chất diện hoạt Tween 80 trong bản thân hệ tiểu phân nano, trong môi trường hòa tan và sự có mặt của polyme thân nước PVP. Tween 80 là một chất làm tăng độ tan và gây thấm tốt [56]. Tween 80 có khả năng tạo cấu trúc micel trong môi trường hòa tan. Polyme thân nước PVP tạo phức với phần curcumin hòa tan dẫn đến độ hòa tan tăng nhanh đặc biệt trong giai đoạn đầu.
Độ tan
Một số nghiên cứu đánh giá độ tan của curcumin bằng cách khuấy đến bão hòa một lượng curcumin trong môi trường nước ở nhiệt độ thích hợp. Sau đó, tiểu phân curcumin chưa hòa tan được loại bằng cách lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,2 µm [47]. Thực tế, cơ chế giữ lại các tiểu phân trên bề mặt màng lọc còn có thể do sự hấp phụ của các tiểu phân trên bề mặt màng lọc, gây bít kín các lỗ lọc hoặc do cấu trúc của lỗ lọc có thể giữ lại tiểu phân bên trong. Vì vậy, việc sử dụng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,2 µm có thể có hiệu quả trong việc loại bỏ các tiểu phân curcumin chưa hòa tan. Phương pháp lọc để loại tiểu phân có thể sử dụng độc lập hoặc kết hợp với phương pháp siêu ly tâm. Với phương pháp này, quá trình tách loại tiểu phân phụ thuộc vào khối lượng tiểu phân trong dịch ly tâm, tốc độ và thời gian cần thiết để các tiểu phân sa lắng hoàn toàn. Vì vậy, thời gian ly tâm phải đủ dài. Tốc độ ly tâm còn phụ thuộc vào bán kính ly tâm, tức là khoảng cách từ vị trí đặt mẫu đến trung tâm của rotor. Với cùng tốc độ ly tâm như nhau nhưng bán kính ly tâm lớn, lực tác động lên tiểu phân sẽ lớn. Trong điều kiện hiện có, để tách loại tiểu phân, có thể lọc qua lọc sơ bộ qua màng lọc kích thước lỗ lọc 5 µm nhằm làm giảm khối lượng tiểu phân đem ly tâm. Quá trình siêu ly tâm được tiến hành với tốc độ 12000 vòng/phút. Dịch thu được lọc 1 lần qua màng lọc kích thước lỗ lọc 0,2 µm để cho các tiểu phân hấp phụ lên bề mặt màng lọc. Sau đó, dịch lọc được tiếp tục lọc lần 2 để tăng hiệu quả lọc. Kết quả thực nghiệm cho thấy: với tốc độ ly tâm 12000 vòng/phút và màng lọc kích thước lỗ lọc 0,2 µm, dịch lọc thu được trong. Kết quả đánh giá độ tan của hệ tiểu phân nano ở mục 3.4.3.8 đã phần nào chứng minh được độ tan của hệ tiểu phân nano cải thiện đáng kể so với nguyên liệu ban đầu.
Cấu trúc của hệ tiểu phân nano
Hệ tiểu phân nano sau khi bào chế có cấu trúc gần hình cầu trong đó curcumin được phân tán vào bên trong cấu trúc của polyme thân nước PVP. PVP nóng chảy, sau đó gel hóa và đông tụ lại tạo cấu trúc hình cầu, “nhốt” tiểu phân curcumin vào trong. Với cấu trúc này, không thể dựa vào sự hấp phụ khí nitrogen lên bề mặt tiểu phân theo thuyết BET để xác định KTTP giống như curcumin nguyên liệu và curcumin sau giai đoạn nghiền khô. Do có sự tạo phức với PVP, một phần hệ tiểu phân chuyển sang dạng vô định hình. Cấu trúc này của hệ tiểu phân nano tương tự như cấu trúc của tiểu phân nano raloxifen trong nghiên cứu của Hiep T. T. và cộng sự.
So sánh với hệ tiểu phân nano curcumin bào chế với tá dược PVP bằng phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao của Rachmawati H. và cộng sự, tiểu phân nano tồn tại dưới dạng các đám kết tụ xốp hình cầu, giống như bọt với kích thước khoảng 400 nm [75]. Sự khác nhau này có thể do bản thân nguyên liệu ban đầu có các đặc tính về kết tinh, hình dạng và kích thước tinh thể khác nhau. Trong nghiên cứu của Rachmawati H. và cộng sự, curcumin ở dạng phiến hình dạng không xác định, kích thước không đồng nhất và phân bố kích thước rộng. Khi chuyển sang dạng nano, tiểu phân nano có kích thước đồng nhất hơn, phân bố kích thước hẹp. Còn trong nghiên cứu này, curcumin ở dạng tinh thể hình kim, các cạnh sắc và rõ, với kích thước khá lớn. Khi bào chế dưới dạng hệ tiểu phân nano, trên hình ảnh chụp sau khi rửa loại tá dược, không còn thấy sự xuất hiện của các tinh thể hình kim mà chỉ có các tiểu phân có hình dạng gần hình cầu (mục 3.4.3.1). Tuy nhiên, không loại trừ khả năng sau khi rửa loại tá dược bằng nước, tiểu phân nano curcumin có thể bị kết tinh trở lại. Điều này có thể làm cho KTTP tăng lên so với KTTP trước khi rửa loại tá dược.
Kích thước tiểu phân trung bình và hệ số đa phân tán (trong nước chứa Tween 80)
Một trong những đặc tính quan trọng của tiểu phân nano là kích thước tiểu phân dược chất. Kích thước tiểu phân của hỗn dịch nano có thể được xác định bằng nhiều kỹ thuật phân tích khác nhau như nhiễu xạ laze, phổ tương quan photon (tán xạ laze), đếm tiểu phân và kính hiển vi điện tử quét.
KTTP của hỗn dịch nano thu được bằng phương pháp nhiễu xạ laze và phổ tương quan photon không giống nhau vì KTTP đo bằng phương pháp nhiễu xạ laze dựa trên thể tích và đường kính trung bình, còn phổ tương quan photon biểu diễn dưới dạng kích thước theo cường độ ánh sáng. Kích thước tiểu phân đo bằng phương pháp nhiễu xạ laze thường cao hơn so với phương pháp tương quan photon. Theo nhận định của Sepassi S. và cộng sự, nếu sử dụng kỹ thuật nhiễu xạ laze, KTTP xác định được cao gấp đôi so với kết quả thu được nếu sử dụng phương pháp phổ tương quan photon [85]. Phương pháp đếm tiểu phân cho số lượng chính xác tiểu phân trên một đơn vị thể tích đối với từng nhóm tiểu phân kích thước khác nhau, kỹ thuật này hiệu quả và thích hợp hơn so với phân tích nhiễu xạ laze trong việc xác định số lượng tiểu phân kích thước micro trong hỗn dịch nano [70]. Tuy nhiên, phương pháp nhiễu xạ laze có thể xác định khoảng KTTP rộng với giá trị trung bình trong khoảng nano, thao tác nhanh, dễ thực hiện, chính xác và giá trị trung bình thu được từ phương pháp nhiễu xạ laze thường chính xác trong khoảng nano.
Căn cứ vào một số ưu, nhược điểm nhất định của các phương pháp xác định KTTP kết hợp với điều kiện trang thiết bị hiện có, nghiên cứu của luận án lựa chọn phương pháp xác định KTTP trong giai đoạn nghiền khô và nghiền ướt bằng nhiễu xạ laze. Còn trong giai đoạn đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn, KTTP được xác định bằng phương pháp tán xạ laze.
Để chuẩn bị mẫu, trong phương pháp nhiễu xạ laze, mẫu thử cần được phân tán trong môi trường đến mức độ che mờ chấp nhận được để xác định KTTP. Trong phương pháp tán xạ laze, mẫu thử được pha loãng sao cho tốc độ đếm tiểu phân nằm trong khoảng 150-250 kcps. Nếu tốc độ đếm tiểu phân quá thấp, độ tin cậy của kết quả đo KTTP thấp, còn nếu tốc độ đếm tiểu phân cao, có thể xảy ra hiện tượng đa tán xạ, ảnh hưởng đến kết quả đo. Để tránh kết tụ tiểu phân, mẫu thử trong quá trình nghiền khô được phân tán trong nước chứa Tween 80 với nồng độ thấp 0,1%. Đối với mẫu thử trong giai đoạn nghiền ướt, giai đoạn đồng nhất hóa và bột thu được sau phun sấy chứa nano curcumin, thực nghiệm cho thấy: nano curcumin phân tán nhanh và không bị kết tụ trong môi trường nước khi phân tán trong nước chứa Tween 80. Do đó, mẫu thử được chuẩn bị bằng cách pha loãng hỗn dịch hoặc phân tán bột phun sấy chứa nano curcumin trong nước chứa Tween 80. Một số nghiên cứu còn tiến hành pha loãng mẫu thử trong môi trường bão hòa hoàn toàn hoặc bão hòa một phần để xác định KTTP [102]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, KTTP của nano curcumin không bị ảnh hưởng bởi môi trường pha loãng nên nghiên cứu lựa chọn môi trường phân tán là nước.
Kết quả xác định KTTP có thể biểu diễn dưới dạng phân bố KTTP theo thể tích hoặc theo khối lượng. Từ các thông số về KTTP, trung bình momen thể tích được lựa chọn vì đặc tính nhạy với sự có mặt của các tiểu phân kích thước lớn trong mẫu và cho biết có bất kỳ tiểu phân có kích thước lớn nào tồn tại trong hỗn dịch nano thậm chí khi số lượng tiểu phân nhỏ, nhưng khối lượng của các tiểu phân cũng tương đối lớn.
Việc so sánh về KTTP giữa các nghiên cứu khác nhau không chỉ phụ thuộc vào phương pháp sử dụng để xác định KTTP mà còn phụ thuộc vào thông số quang học lựa chọn. Khi thay đổi thông số quang học, KTTP và PDI có thay đổi. Đồng thời, nếu mẫu có mặt tiểu phân kích thước nhỏ và kỹ thuật phân tích tiến hành trong chế độ đo KTTP chỉ thích hợp với tiểu phân kích thước nhỏ, sự có mặt của tiểu phân có kích thước lớn hơn không thể phát hiện được. Vì vậy, giữa các nghiên cứu khác nhau hoặc thậm chí giữa những lần thực nghiệm khác nhau, KTTP và PDI có thể khác nhau do nhiều nguyên nhân chưa rõ ràng [49].
Kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy: hệ tiểu phân nano thu được ở quy mô bào chế 5 gam/mẻ có đặc tính về KTTPTB và PDI trước phun sấy và sau phân tán khoảng 300-500 nm, PDI 0,30-0,55, cao hơn so với mẫu bào chế ở quy mô nhỏ 1 gam/mẻ (mục 3.4.3.2). So với kết quả nghiên cứu bào chế hỗn dịch nano curcumin của Gao Y. và cộng sự, tiểu phân nano thu được có kích thước tiểu phân xác định bằng phương pháp phổ tương quan photon khoảng 210,2 nm [29]. Trong nghiên cứu của Rachmawati H. và cộng sự, tiểu phân nano curcumin có kích thước tiểu phân khá lớn (500-700 nm) xác định bằng phương pháp phổ tương quan photon với thông số quang học khác với nghiên cứu này (hệ số phản xạ 1,5) [75]. Trong nghiên cứu của Shaikh J. và cộng sự, KTTPTB của nano curcumin khoảng 334 nm với PDI 0,25 [66], [75].
Qua phân tích ở trên có thể thấy phương pháp tán xạ laze không thích hợp khi phân tích mẫu chứa cả các tiểu phân kích thước lớn và nhỏ. Khi xác định KTTP của mẫu chứa tiểu phân kích thước lớn hơn ở giới hạn micro, có thể sử dụng thiết bị Mastersizer 3000E hoặc kỹ thuật SEM. Thực tế, các tiểu phân có kích thước tương đối lớn hơn được quan sát bằng kỹ thuật SEM. Do đó, KTTP được phân tích kết hợp bằng cả hai kỹ thuật tán xạ laze và chụp SEM.
Khi đưa giá trị KTTP, một thông số quan trọng đi kèm là hệ số đa phân tán PDI. Giá trị PDI cho biết độ ổn định vật lý của hỗn dịch nano và hệ số này càng thấp, hỗn dịch nano càng ổn định. Trong nghiên cứu này, tiểu phân nano bào chế được có khoảng phân bố kích thước tiểu phân khá lớn. Đây cũng là nhược điểm của phương pháp phân chia tiểu phân đến kích thước nano đi từ tiểu phân kích thước lớn.
Phổ nhiễu xạ tia X và giản đồ nhiệt vi sai của hệ tiểu phân nano
Đối với một số dược chất, quá trình chuyển sang dạng tiểu phân kích thước nano có thể làm thay đổi trạng thái kết tinh hoặc tạo dạng đa hình. Kết quả của nghiên cứu ở mục 3.4.3.4 cho thấy: khi chuyển sang dạng nano, curcumin vẫn tồn tại ở trạng thái kết tinh nhưng tỷ lệ kết tinh đã giảm đi so với ban đầu.
Nhằm xác định rõ hơn các đặc tính kết tinh của curcumin như đặc tính chuyển pha sang trạng thái thủy tinh, điểm kết tinh và điểm nóng chảy, phương pháp giản đồ nhiệt vi sai được lựa chọn. Bên cạnh việc xác định trạng thái vật lý của dược chất, phương pháp này cũng có thể sử dụng để xác định tương tác dược chất-tá dược có thể xảy ra trong quá trình bào chế. Sự xuất hiện các pic lạ hoặc sự dịch chuyển pic thu nhiệt của curcumin trên giản đồ nhiệt vi sai có thể xảy ra khi có mặt các tá dược khác trong công thức bào chế. Theo kết quả giản đồ nhiệt vi sai trình bày ở mục 3.4.3.4 có thể thấy sự dịch chuyển pic thu nhiệt và sự giảm enthalpy nóng chảy. Điều này xảy ra có thể do hiệu ứng dung môi của PVP trong quá trình cung cấp nhiệt. Pic thu nhiệt tương ứng điểm nóng chảy là pic tạo bởi phần curcumin không tạo phức, chứng tỏ dạng kết tinh của curcumin vẫn còn tồn tại trong hệ tiểu phân. Kết quả này phù hợp với nhận định của một số tác giả khi nghiên cứu về hệ phân tán rắn chứa PVP [45] và cũng phù hợp với kết luận rút ra từ hình ảnh phổ nhiễu xạ tia X ở trên. Ngoài pic thu nhiệt, trên giản đồ nhiệt vi sai của hệ tiểu phân nano curcumin còn có một pic ở nhiệt độ 57,4oC do sự có mặt của nước trong hệ tiểu phân và một pic ở 128,2oC do hiệu ứng chuyển pha.
Diện tích bề mặt và độ xốp
Nguyên tắc của phương pháp dựa trên sự hấp phụ chất khí lên bề mặt hoặc vào trong cấu trúc của tiểu phân rắn bằng hấp phụ vật lý hoặc hóa học. Khi tiểu phân curcumin được phân chia đến kích thước nhỏ nhất định, tổng diện tích bề mặt tăng, do đó diện tích bề mặt theo thuyết BET tăng.
Sau giai đoạn nghiền khô, tiểu phân curcumin có KTTP giảm và diện tích bề mặt tăng. Kết quả đánh giá diện tích bề mặt theo thuyết BET ở mục 3.4.2.1 cho thấy diện tích bề mặt tăng lên khoảng gấp 5 lần. Thực tế, quá trình phân chia tiểu phân trong giai đoạn nghiền khô thành các tiểu phân kích thước nhỏ hơn làm tăng năng lượng tự do bề mặt tiểu phân. Các tiểu phân có xu hướng bị kết tụ với nhau ở trạng thái rắn, do vậy, diện tích bề mặt xác định được có thể không còn chính xác.
Khi chuyển sang dạng tiểu phân nano, diện tích bề mặt lại không xác định được theo thuyết BET. Điều này có thể do nguyên tắc của phương pháp đánh giá diện tích bề mặt này dựa theo thuyết BET về sự hấp phụ khí nitrogen lên bề mặt các lỗ xốp. Đối với mẫu tiểu phân nano, curcumin phân tán vào trong cấu trúc hình cầu của chất mang PVP có thể gây bít các lỗ xốp trên bề mặt và bên trong tiểu phân, cản trở sự hấp phụ khí nitrogen. Do những đặc điểm khác biệt hoàn toàn của hệ tiểu phân nano so với nguyên liệu ban đầu và mẫu nghiền khô, sự hấp phụ khí nitrogen lên bề mặt tiểu phân trở nên phức tạp và không thể tính toán được.