Theo dõi độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat
Sản phẩm đông khô TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) artesunat được đựng trong lọ thủy tinh không màu, đậy nút cao su và nắp nhôm, bảo quản trong 1 năm ở nhiệt độ 5 ± 3oC (trong ngăn mát tủ lạnh) và điều kiện thực (trong phòng thí nghiệm với nhiệt độ 15-35oC, độ ẩm 50-90%) .
Sau từng thời gian 3 tháng, lấy mẫu đánh giá các đặc tính lý hóa của TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) bao gồm: KTTP trung bình, hàm lượng dược chất, hàm ẩm, và một số chỉ tiêu của bột pha tiêm như cảm quan, khả năng phân tán lại theo các phương pháp như đã đề cập ở mục 2.4.4. Đánh giá lại khả năng giải phóng hoạt chất, cấu trúc tiểu phân sau khi bảo quản 1 năm theo phương pháp đã đề cập ở mục 2.4.4.
Theo dõi độ ổn định của hỗn dịch chứa tiểu phân nano artesunat sau khi pha lại
Phối hợp bột đông khô pha tiêm chứa TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) artesunat vào môi trường phân tán để tạo hỗn dịch nano ART. Bảo quản ở nhiệt độ 5 ± 3oC (trong ngăn mát tủ lạnh) và điều kiện thực (trong phòng thí nghiệm với nhiệt độ 15-35oC, độ ẩm 50-90%) trong vòng 4 giờ sau đó đánh giá lại hàm lượng dược chất, KTTP trung bình của ART.
Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro và in vivo
Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro
Đánh giá khả năng thấm vào tế bào
Hai dòng tế bào MCF-7 và A549 được nuôi cấy trong đĩa 6 giếng với mật độ 2x105 tế bào/giếng trong 24 giờ. Tế bào được rửa bằng dung dịch phosphat buffer salin (PBS) , sau đó 1 ml hỗn dịch nano coumarine 6-(C6) -PLGA hoặc C6/PLGA- CS (bào chế bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi và hấp phụ vật lý tương tự như phương pháp đã đề cập ở mục 2.4.1.1) với nồng độ 2 hoặc 4 μg/ml được thêm vào từng giếng và ủ ở 37oC trong 30 hoặc 60 phút. Tế bào được trypsin hóa và ly tâm ở tốc độ 1000 vòng trong 5 phút để thu lấy tế bào. Tiếp tục rửa tế bào và phân tán lại trong dung dịch PBS, rồi tiến hành đo cường độ tín hiệu huỳnh quang dựa vào kỹ thuật phân tích tế bào dòng chảy (flow cytometry analysis) ở máy BD FACS Verse (BD Biosciences, Mỹ) [37], [152].
Đánh giá độc tính tế bào in vitro
Đối với tiểu phân nano ART/PLGA-CS
Đối với TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) artesunat sử dụng PLGA và CS, thử độc tính tế bào in vitro được tiến hành dựa vào phương pháp định lượng MTT. Trong đó, 100 µl hỗn dịch chứa tế bào ở mật độ 1×104 tế bào/ml được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng và ủ trong 24 giờ. Các mẫu gồm TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) trắng PLGA-CS, artesunat nguyên liệu, TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) ART/PLGA và ART/PLGA-CS (với nồng độ artesunat tương ứng là 6,25, 12,5, 25, 50, 100 µg/ml) được thêm vào các giếng và ủ trong 24 giờ. Sau đó, loại bỏ môi trường và thêm 100 µl dung dịch MTT nồng độ 1,25 mg/ml trong môi trường DMEM vào từng giếng tương ứng, rồi tiến hành ủ trong 4 giờ. Tiến hành hút bỏ môi trường MTT và thêm 100 µl DMSO vào từng giếng. Rồi ủ trong 15 phút và đo độ hấp thụ tại bước sóng 570 nm (OD570) sử dụng thiết bị đọc đĩa (Multiskan EX, Thermo Scientific, Mỹ) . Khả năng sống sót của tế bào được tính toán dựa vào công thức sau [152]:
Khả năng sống sót(% ) = OD570(thử) OD570(trắng) / OD570(chứng) OD570(trắng)
Đối với tiểu phân nano ART/PLGA-Polyethylene glycol PEG
Đối với TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) ARTESUNAT sử dụng PLGA và PEG, phép thử độc tính tế bào in vitro được thực hiện theo phương pháp của Monks (1991) dựa vào phương pháp nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB) . Trong đó, 100 µl hỗn dịch chứa tế bào LLC ở mật độ 1×104 tế bào/ml được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng và ủ trong 24 giờ. Các mẫu gồm TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) PLGA-Polyethylene glycol PEG (mẫu trắng, blank) , artesunat nguyên liệu (pha trong DMSO) , TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) ART/PLGA-Polyethylene glycol PEG (pha từ bột đông khô với nồng độ artesunat tương ứng là 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 µg/ml) được thêm vào các giếng và ủ trong 24 hoặc 48 giờ. Paclitaxel ở các nồng độ 20; 10; 5; 2,5; 1,25 µg/ml được sử dụng như là chất đối chứng dương. Dung dịch DMSO 10% được sử dụng làm đối chứng âm. Giếng không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (190 µl) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0, tế bào sẽ được cố định bằng acid tricloracetic. Sau đó, loại bỏ môi trường và cố định tế bào bằng 50 μl acid tricloracetic 4% lạnh. Tiếp tục thêm 100 μl SRB 0,4% (kl/tt) để nhuộm tế bào trong 30 phút ở 37 oC, rửa 3 lần bằng dung dịch acid acetic 1% rồi để khô ở nhiệt độ phòng. Thêm 100 μl 10 mM Tris dạng base để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút. Đo độ hấp thụ tại bước sóng 515 nm trên máy đọc đĩa ELISA (Bio-Rad, Mỹ) (OD515) . Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Tỉ lệ ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau [118]:
Tỉ lệ ức chế (% ) = OD515(thử) OD (ngày 0) = OD515 (chứng âm) OD (ngày 0)
Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần
mềm máy tính TableCurve 2Dv5.01.
a.Đánh giá biến đổi hình thái nhân tế bào
Các tế bào được nuôi cấy trong đĩa 6 giếng ở mật độ 2x105 tế bào/giếng trong môi trường DMEM ở 37oC, 5% CO2 trong 24 giờ. Sau khi thêm các mẫu gồm artesunat nguyên liệu, TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) ART/PLGA và ART/PLGA-CS vào các giếng và ủ trong 24 giờ, các tế bào được rửa bằng PBS 3 lần và cố định bằng paraformaldehyd 4% trong 10 phút. Tiếp theo, các tế bào được rửa bằng PBS trước khi được nhuộm bằng dung dịch Hoechst 33342 5μg/ml ở nhiệt độ phòng trong 15 phút trong bóng tối. Các tế bào được rửa bằng dung dịch PBS 3 lần. Theo dõi hình ảnh nhân tế bào dưới kính hiển vi điện tử huỳnh quang (Nikon, Tokyo, Nhật) [153].
Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vivo
Gây u cho chuột bằng dòng tế bào LLC
Tế bào LLC được nuôi trong môi trường DMEM có bổ sung 10% huyết thanh phôi bò và 1% kháng sinh ở 370C và 5% CO2, khi tế bào mọc tốt tiến hành thu hoạch và tiêm vào bắp đùi chuột thuần chủng BALB/c khoẻ mạnh nồng độ 2x106 tế bào/con (là nồng độ gây u cho chuột thí nghiệm) . Sau khi khối u đạt kích thước phù hợp (khoảng 400 mm3 tương ứng 4 ngày tiêm tế bào) , tiến hành đánh giá tác dụng ức chế sự phát triển của khối u đối với các công thức thuốc theo đường tiêm tĩnh mạch đuôi [154].
Xác định khả năng ức chế khối u in vivo của bột pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat trên mô hình chuột bị gây u bằng dòng tế bào LLC 18 chuột BALB/c khoẻ mạnh đã được gây u với kích thước khoảng 400 mm3, có độ tuổi từ 8-9 tuần tuổi, được chia làm 3 lô (6 chuột/lô) , sử dụng đường tiêm tĩnh mạch đuôi (i.v.) :
Nhóm 1 (Bệnh lý i.v.) : tiêm 200 µl (25 gram khối lượng cơ thể) nước muối sinh lý, 2 ngày/1 lần, trong thời gian 14 ngày;
Nhóm 2 (Nano 60 mg/kg i.v.) : tiêm một thể tích hỗn dịch chứa TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) artesunat liều 60 mg/kg/ngày (khoảng 200 µl hỗn dịch (tùy theo khối lượng chuột) sau khi phân tán lại bột đông khô chứa TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) artesunat 20 mg bằng 2 ml nước cất pha tiêm) , tiêm i.v., 2 ngày/1 lần trong thời gian 14 ngày;
Nhóm 3 (NL 60 mg/kg i.v.) : tiêm một thể tích dung dịch artesunat nguyên liệu (bột pha tiêm, lọ 60mg + 1 ml NaHCO3 5% + 5 ml NaCl 0,9%) liều 60 mg/kg/ngày (khoảng 150 µl dung dịch (tùy theo khối lượng chuột) ) , 2 ngày/1 lần; trong thời gian 14 ngày;
Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế khối u in vivo của bột pha tiêm chứa TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) ARTESUNAT trên mô hình chuột gây u bằng dòng tế bào LLC khi dùng đường tiêm tĩnh mạch đuôi
Với bố trí thí nghiệm như trên, khả năng kháng u ung thư của TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) ART thông qua việc ức chế sự phát triển của khối u được nghiên cứu. Kết quả được so sánh với Đối chứng bệnh lý của thí nghiệm.
Theo dõi chuột hàng ngày, cân khối lượng và đo kích thước khối u sơ cấp tại vị trí tiêm 5-7 ngày/lần theo phương pháp của Iigo et al. (1991) , Eun-Ok Lee el al. (2006) [83], [103] để xác định khả năng ức chế khối u của TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) ART. Thể tích khối u được tính theo công thức của Iigo (1991) .
V = a xb2/2
Trong đó: V : thể tích khối u
a : chiều dài khối u
b : đường kính khối u
Xử lý số liệu
Phân tích thống kê như ANOVA 1 chiều (Tukey post-hoc test) , kiểm định t- student, hay kiểm định phù hợp được tiến hành với phần mềm Origin 9.0, Microsoft Excel 2010. Mỗi thí nghiệm được tiến hành 3 lần. Mức ý nghĩa là 0,05.