Việc bảo quản Tiểu phân nano dưới dạng hỗn dịch, nồng độ chất nhũ hóa tween 80 sử dụng gặp nhiều nhược điểm như: thể tích nước lớn, hàm lượng dược chất trong 1 đơn vị thể tích thấp, dễ nhiễm vi sinh vật, polymer, nồng độ chất nhũ hóa tween 80 có thể bị thuỷ phân trong quá trình bảo quản, dược chất bị mất dần hoạt tính, các Tiểu phân nano có thể bị kết tụ, sa lắng. Để loại nước và tăng độ ổn định cho TP nano, đông khô là phương pháp thường được sử dụng nhất. Đông khô là một quá trình làm khô dung dịch nước đã được đông lạnh ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ eutectic của dung dịch, dung môi được loại trực tiếp từ pha rắn, không qua pha lỏng dưới áp suất giảm, cho ra sản phẩm khô.
Mặc dù thử nghiệm đông đá - rã đông là bước sàng lọc nhanh giúp đánh giá tác dụng của các tá dược, chất nhũ hóa polysorbate 80 bảo vệ đến sự kết tụ của các Tiểu phân nano trong quá trình đông khô, tuy nhiên, ý nghĩa của thử nghiệm này trong nghiên cứu chúng tôi thật sự không đáng kể. Như mẫu không có sử dụng tá dược bảo vệ, sự tăng KTTP vẫn nhỏ do đặc tính của copolyme PLGA-PEG đặc biệt là hợp phần PEG. Polyethylene glycol hấp phụ hay gắn trên bề mặt các tiểu phân và tạo ra sự cản trở không gian. Chính vì thế, Polyethylene glycol, đặt tính chất nhũ hóa tween 80 được sử dụng như một chất bảo vệ trong quá trình đông khô trong rất nhiều nghiên cứu [8], [120], … Một số nghiên cứu sử dụng copolyme PLGA-PEG có thể tiến hành đông khô mà không sử dụng các chất bảo vệ [157]. Tuy nhiên, cũng có nghiên cứu chỉ ra rằng Polyethylene glycol chỉ phát huy hiệu quả bảo vệ trong quá trình đông đá – rã đông mà tỏ ra kém hiệu quả trong giai đoạn loại bỏ dung môi của quá trình đông khô hay nói cách khác Polyethylene glycol đóng vai trò là chất bảo vệ quá trình đông đá (cryoprotectant) chứ không phải là chất bảo vệ quá trình làm khô (lyoprotectant) [50]. Một số nghiên cứu cho rằng các đường có tác dụng bảo vệ hiệp đồng với PEG khi làm tăng nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh Tg, ức chế sự kết tinh của Polyethylene glycol và do đó khả năng bảo vệ sẽ tốt hơn [85], [120]… Do đó, để lựa chọn tá dược bảo vệ thích hợp, nghiên cứu đã tiến hành khảo sát sự tăng KTTP sau khi đông khô.
Tuy vậy, bản thân quá trình đông khô cũng sinh ra các điều kiện khắc nghiệt có thể gây mất ổn định và thay đổi các đặc tính Tiểu phân nano [46]. Do vậy, thành công của quá trình đông khô phụ thuộc rất nhiều vào thành phần công thức, nồng độ tween 80 sử dụng và các thông số kỹ thuật trong quá trình đông khô [8].
Có nhiều thành phần trong công thức chứa Tiểu phân nano có tác dụng bảo vệ Tiểu phân nano chống lại các tác động tiêu cực khác nhau từ quá trình đông khô như loại và nồng độ tá dược, tween 80 sử dụng tạo bánh, các nhóm chức hóa học gắn kết ở bề mặt tiểu phân,... [8]. Trong giai đoạn đông rắn của quá trình đông khô, các tá dược tạo bánh sẽ giúp hình thành lớp bao thủy tinh (glassy coating) xung quanh Tiểu phân nano giúp chúng bảo vệ chống lại các tác động như lực cơ học của các tinh thể đá, do đó sẽ ngăn cản sự kết tụ [46]. Trong đó, đường là các tá dược bảo vệ hay tá dược tạo bánh thường được sử dụng trong quá trình đông khô các TP nano.
Về lựa chọn tá dược và chất tween 80 tạo bánh, thông qua kết quả khảo sát ở bảng 3.14, hình 3.25 và hình 3.26 cho thấy saccarose có tác dụng bảo vệ Tiểu phân nano trong quá trình đông khô nhưng với thể tích hỗn dịch nano lớn thì phải cần đến nồng độ 10% thì cấu trúc của bánh mới hình thành vững chắc, không bị co ngót. Khi thể tích hay nồng độ của hỗn dịch nano trước khi đông khô lớn sẽ đòi hỏi nồng độ tác nhân bảo vệ cao hơn. Tuy nhiên, nếu nồng độ này cao quá có thể làm tăng kích thước tiểu phân do ái lực cao của các polyme với carbohydrat làm ngăn cản quá trình phân tán lại bột đông khô hoặc làm xáo trộn quá trình tái cấu trúc, làm mất sự ổn định của hệ nano [8], [49]. Tương tự trong nghiên cứu của Saez về quá trình đông khô Tiểu phân nano PLGA hay PCL (polycaprolacton) cũng cho thấy chỉ có saccarose khi dùng với nồng độ thích hợp là 20% (kl/tt) mới có tác dụng bảo vệ tránh sự kết tụ tiểu phân [137]. Nghiên cứu của Anhorn cũng cho thấy đường saccarose ở nồng độ 2-3% (kl/tt) mới có tác dụng duy trì KTTP và PDI của Tiểu phân nano HSA (Human serum albumin) chứa doxorubicin sau khi đông khô [15]. Vì vậy, các yếu tố của công thức trước đông khô như thể tích hay nồng độ của các TP nano, loại chất mang,... sẽ ảnh hưởng đến nồng độ đường saccarose tối ưu sử dụng để đạt được hiệu quả bảo vệ tránh sự kết tụ các tiểu phân.
Do ―nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh của dung dịch đậm đặc đông đá tối đa‖ (glass transition temperature of maximally freeze concentrated solution, T‘g) của saccarose thấp (khoảng -32oC), nhằm có thể tăng nhiệt độ này từ đó có thể điều chỉnh quy trình để rút ngắn được thời gian đông khô, các tá dược tạo bánh khác như PVP K30, dextran T40 (có T‘g lớn hơn so với saccarose, tương ứng khoảng -20oC, - 12oC) hoặc manitol (tá dược tạo bánh thường sử dụng trong đông khô do có bản chất tinh thể) được kết hợp với saccarose [131], [137]. Tuy nhiên, kết quả ở hình 3.27 cho thấy việc kết hợp với các tá dược này đã làm tăng KTTP so với mẫu chỉ sử dụng saccarose, đặc biệt khi sử dụng các tá dược này ở nồng độ lớn. Kết quả nghiên cứu của Hinrichs về việc đánh giá tác dụng bảo vệ của các loại dextran khác nhau (KLPT biến thiên từ 1,5-40 kDa) cho thấy mức độ kết tụ của các tiểu phân tăng khi tăng KLPT của dextran cũng như khi tăng khả năng PEG hóa của các Tiểu phân nano [79]. Tương tự, nghiên cứu của Saez về đông khô Tiểu phân nano PLGA cũng cho thấy việc sử dụng dextran, manitol với nồng độ 15% đã làm tăng đáng kể khả năng kết tụ của các tiểu phân làm cho các tiểu phân khó phân tán lại so với công thức sử dụng saccarose [137]. Việc thêm dextran hay manitol dường như ngăn cản saccarose thể hiện hiệu quả bảo vệ đầy đủ của nó, có lẽ bởi vì chúng cạnh tranh để bao phủ bề mặt của các Tiểu phân nano như trong nghiên cứu của De Chasteigner [49]. Ngoài ra, điều này cũng có thể giải thích là do sự tương thích của saccarose với PEG trong khi các tá dược tạo bánh khác và PEG thì không tương thích. Chính sự tương thích này dẫn đến tác dụng ngăn cản sự kết tụ của các Tiểu phân nano được PEG hóa như saccarose trong nghiên cứu này [79].
Có thể giải thích cơ chế bảo vệ của saccarose như sau: saccarose là tá dược vô định hình bảo vệ Tiểu phân nano bằng cách hình thành cấu trúc dạng thủy tinh hóa ổn định giữ cố định Tiểu phân nano khi nước đóng băng trong quá trình đông lạnh, cấu trúc này có độ nhớt cao và tính di động thấp do đó ngăn ngừa sự kết tụ và bảo vệ Tiểu phân nano khỏi các tinh thể băng. Ngoài ra, trong nghiên cứu này, saccarose là một dạng đường đôi nên có hiệu quả bảo vệ tốt hơn so với các đường đơn như manitol, có lẽ do liên quan đến trạng thái kết tinh của loại đường sử dụng trong công thức sau đông khô [8].
Từ kết quả ở bảng 3.15 và hình 3.28 cho thấy thể tích của hỗn dịch đông khô ảnh hưởng đến hình thức tính chất của bánh đông khô. Các mẫu có thể tích lớn, yêu cầu thời gian đông khô dài hơn. Thể tích 10 ml của hỗn dịch nano đóng vào lọ thủy tinh đường kính ngoài 3 cm trước khi đông khô dường như gần thể tích tối đa cho phép để đảm bảo độ cao của hỗn dịch trong lọ khoảng 2 cm tạo điều kiện cho giai đoạn thăng hoa hơi nước trong quá trình đông khô. Vì vậy, để quá trình đông khô với các mẫu này có thể xảy ra hoàn toàn tức hầu hết lượng nước có thể thăng hoa đòi hỏi thời gian đông khô kéo dài hơn trên 24 giờ so với khi đông khô các mẫu có thể tích nhỏ hơn [39].
Mặc dù, sau khi quá trình sấy sơ cấp kéo dài 48 giờ kết thúc, tất cả đá đông đã thăng hoa tuy nhiên, lượng ẩm gắn kết vẫn còn trong sản phẩm. Sản phẩm tuy bề ngoài vẫn khô, đạt về cảm quan sau đông khô nhưng hàm ẩm trong mẫu vẫn còn cao có thể đến 7-8%. Vì vậy, quá trình sấy thứ cấp 5 giờ là cần thiết để làm giảm hàm ẩm còn lại trong mẫu đến giá trị yêu cầu, đồng thời giúp sản phẩm ổn định trong quá trình bảo quản [101].
Ngoài ra, trong quá trình đông khô, các yếu tố khác thuộc quy trình đông khô như nhiệt độ bên ngoài buồng đông khô, sự bức xạ từ thành thiết bị đông khô cũng có thể gây ảnh hưởng đến chất lượng của bánh sau đông khô [39]. Do vậy, nghiên cứu cũng đã có một số giải pháp nhằm hạn chế sự ảnh hưởng của các yếu tố này như dùng điều hòa để duy trì nhiệt độ bên ngoài buồng đông khô dưới 25oC, bọc lớp cách nhiệt và giấy nhôm bên ngoài buồng đông khô.
Về thiết bị đông khô, nghiên cứu đã sử dụng thiết bị đông khô Christ Alpha 1-LD (Đức) không có kết hợp bộ phận điều chỉnh nhiệt độ của giá đỡ, cũng như không có chức năng điều chỉnh độ chân không của buồng đông khô như các máy đông khô hiện đại khác, ví dụ Alpha 2-4 LSCplus của cùng hãng Christ hay các dòng FreeZone Triad của hãng Labconco, LyoAlfa của hãng Telstar. Tuy nhiên, bằng việc điều chỉnh, thiết kế công thức và quy trình đông khô như ở trên, nghiên cứu đã bước đầu bào chế được công thức bột đông khô pha tiêm chứa Tiểu phân nano artesunat đạt tiêu chuẩn chất lượng đề ra.
Với việc hạn chế về thiết bị đông khô, do đó trong nghiên cứu này, quy mô bào chế mới chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm với khoảng 6 lọ với thể tích mỗi lọ là 10 ml chứa 20 mg artesunat cho mỗi lần đông khô. Ngoài ra, do thiết bị đông khô sử dụng trong nghiên cứu không có chức năng điều chỉnh nhiệt độ của giá đỡ, cũng như không có chức năng điều chỉnh độ chân không của buồng đông khô, nên việc khảo sát để nâng hàm lượng dược chất trong mỗi lọ đông khô, tối ưu hóa hơn nữa quy trình và chất lượng sản phẩm đông khô vẫn còn gặp nhiều hạn chế.
Bột đông khô pha tiêm chứa Tiểu phân nano artesunat là sản phẩm có các thành phần không thể thực hiện phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt. Do đó, kỹ thuật pha chế vô khuẩn đã được ứng dụng để bào chế dạng thuốc này.
Trong đó, tất cả các dụng cụ sử dụng trong bào chế bằng các phương pháp thích hợp như hấp ở 121oC/30 phút. Ngoài ra, kỹ thuật lọc vô khuẩn đã được áp dụng để chuẩn bị các dung dịch pha dầu và pha nước. Hầu hết các công đoạn pha chế đều được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn ở tủ an toàn sinh học cấp II.
Ngoài ra, trên thiết bị đông khô Christ Alpha 1-2 LD, bộ phận đóng nút cơ học đã giúp tạo được độ chân không trong lọ bột đông khô giúp hạn chế sự tiếp xúc của sản phẩm với ẩm và khí oxy từ đó giúp tăng cường độ ổn định của sản phẩm trong quá trình bảo quản [101].
Trong thành phần của công thức bột đông khô, ngoài hàm lượng dược chất, lượng tá dược tạo bánh saccarose đã được xác định rõ thì lượng polyme PLGA và PLGA-PEG cũng đã được xác định tỷ lệ với hàm lượng artesunat là 20 mg chứa trong hỗn dịch sau khi tinh chế. Tuy nhiên, để xác định một cách định lượng các polymer, nồng độ tween 80 cần phải sử dụng một số phương pháp hiện đại và phức tạp như sắc ký thấm gel (gel permeation chromatography), phân tích định lượng bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton, hay sắc ký lỏng hiệu năng cao sau khi thủy phân PLGA bằng kiềm như trong nghiên cứu của Zhang [172].