Đánh giá hình thái và kích thước tiểu phân bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM – Scanning Electron Microscope )
Nguyên tắc: chùm điện tử quét trên toàn bộ bề mặt của mẫu được thu lại bởi các đầu dò để biến đổi thành những tín hiệu phản ánh bề mặt và thành phần của mẫu đưa ra màn hình quan sát. Do cách tạo ảnh, các ảnh SEM có đặc điểm của ảnh ba chiều.
Tiến hành: phân tán mẫu bột curcumin trên một khung carbon, sau đó phủ một lớp platin mỏng và đặt vào buồng soi mẫu của thiết bị. Sử dụng kính hiển vi điện tử FESEM Hitachi S-4800 có độ phóng đại M = 20-800000x, độ phân giải δ = 1,0 nm, điện áp gia tốc U = 10 kV.
Xác định kích thước tiểu phân trung bình và khoảng phân bố kích thước tiểu phân sử dụng thiết bị Mastersizer 3000E
Mẫu nguyên liệu được phân tán trong môi trường nước chứa 0,1% Tween 80, pha loãng hỗn dịch đến khi thu được hỗn dịch có độ che mờ khoảng 11-15% (xác định bởi thiết bị Mastersizer 3000E). Khuấy đồng nhất và siêu âm trên thiết bị đo để đảm bảo mẫu thử đồng nhất. Tiến hành đo khi mẫu thử không còn bọt khí.
Từ các thông số thu được về kích thước tiểu phân, trung bình KTTP theo thể tích (d [4,3]) và hệ số Span được sử dụng để đánh giá KTTP và phân bố KTTP.
Phương pháp xác định diện tích bề mặt và độ xốp
Nguyên tắc: dựa theo thuyết hấp phụ Brunauer-Emmet-Teller (BET)
Khi bề mặt tiểu phân rắn tiếp xúc với chất khí, lớp hấp phụ được hình thành trên bề mặt. Lớp hấp phụ cũng được hình thành trên bề mặt lỗ xốp bên trong tiểu phân và khí bị ngưng tụ trong lỗ xốp. Ở nhiệt độ hằng định, lượng khí hấp phụ hoặc ngưng tụ trên bề mặt là hàm số của áp suất khí. Dựa vào sự thay đổi áp suất khí, tính toán được lượng khí hấp phụ hoặc ngưng tụ. Xây dựng đường hấp phụ đẳng nhiệt theo thuyết BET và xác định diện tích bề mặt theo thuyết BET . Thể tích lỗ xốp và đường kính trung bình của lỗ xốp được xác định dựa vào quá trình hấp phụ và phản hấp phụ của khí nitrogen trên bề mặt lỗ xốp.
Tiến hành: Hút chân không và cung cấp nhiệt để làm khô nguyên liệu ở 100oC và làm sạch bề mặt tiểu phân, lỗ xốp. Khi bề mặt tiếp xúc với khí nitrogen, nitrogen sẽ hấp phụ lên bề mặt và hệ thống mao quản của mẫu tại nhiệt độ nitrogen lỏng (- 196oC).
Phương pháp nhiễu xạ tia X (X-ray Diffraction-XRD)
Khi chùm tia X đập vào mặt tinh thể và đi vào trong, mạng tinh thể đóng vai trò như một cách tử nhiễu xạ đặc biệt. Mật độ và cường độ các pic trong phổ XRD thể hiện mức độ kết tinh của DC.
Tiến hành: các mẫu được nghiền mịn, đặt vào khay kim loại, đưa vào thiết bị chiếu tia X với bước sóng tia X tới từ bức xạ Ka của đồng kim loại (Cu) là Cu = 1,5405, cường độ dòng điện 40 mA, điện áp 40 kV, góc quét từ 1-50oC, tốc độ quét 2o/phút.
Phương pháp giản đồ nhiệt vi sai (Differential Scanning Calorimetry-DSC)
Phương pháp giản đồ nhiệt vi sai cho phép xác định các tính chất chuyển pha nhiệt của mẫu thông qua việc đo dòng nhiệt tỏa ra (hoặc thu vào) từ một mẫu được đốt nóng trong dòng nhiệt với nhiệt độ quét ở các tốc độ khác nhau. Mẫu bột được đặt trong đĩa nhôm đục lỗ kín với lượng 5-10 mg. Các phân tích nhiệt được thực hiện với nhiệt độ quét trong phạm vi 30-300oC và tốc độ gia nhiệt 10oC/phút. Trong quá trình có sử dụng khí nitrogen.
Phương pháp đo phổ hồng ngoại (Fourier Transform Infrared Spectroscopy- FTIR)
Bức xạ IR được chuyển tới bộ phận phát hiện, được ghi lại thành phổ IR, thông thường biểu thị dưới dạng độ truyền qua theo số sóng (cm-1).
Lấy khoảng 5-10 mg mẫu phân tích, nghiền mịn và trộn đều với KBr, ép thành viên mỏng rồi đo phổ IR. Riêng mẫu tá dược Tween 80 được đo phổ IR trực tiếp ở thể lỏng.
Phương pháp định lượng
Hàm lượng curcumin trong nguyên liệu được định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis
Chuẩn bị dung môi pha loãng và dung dịch chuẩn như mục 2.3.1.1. Dung dịch thử được chuẩn bị tương tự như dung dịch chuẩn nhưng thay curcumin chuẩn bằng curcumin nguyên liệu. Lọc dung dịch qua màng lọc kích thước lỗ lọc 0,45 µm. Đo độ hấp thụ của mẫu chuẩn và mẫu thử tại bước sóng 427 nm, mẫu trắng là dung môi pha loãng.
Hàm lượng curcumin được tính theo công thức:
% CUR = (Dt / Dc ) x (mc/m) x 100%
Trong đó DT, Dc: độ hấp thụ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn.
mc : khối lượng curcumin chuẩn (mg)
m : khối lượng curcumin thử (mg)
Mỗi mẫu thử làm 3 lần lấy kết quả trung bình.
Phương pháp HPLC
Chuẩn bị dung môi tween polysorbate 80 pha loãng và curcumin nguyên liệu. Hàm lượng curcumin được tính toán theo công thức:
% CUR = (St / Sc ) x (mc / mt) x 100%
Trong đó St, Sc: diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn (mAU.giây).
mc : khối lượng curcumin chuẩn (mg)
mt : khối lượng curcumin thử (mg)
Hàm lượng curcumin cũng có thể được tính toán theo phương trình hồi quy tuyến tính mô tả mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ curcumin xây dựng theo phương pháp ở mục 2.3.1.2. Mỗi mẫu thử làm 3 lần lấy kết quả trung bình.
Phương pháp đánh giá độ tan của curcumin
Phân tán vào mỗi bình nón có nút mài khoảng 0,1 g curcumin trong 100 ml nước tinh khiết. Khuấy từ liên tục trong 24 giờ tại nhiệt độ 25 ± 2oC. Hút dung dịch thử, lọc qua màng lọc kích thước lỗ lọc 5 µm, ly tâm 10 phút với tốc độ 12000 vòng/phút, lấy phần dịch trong, lọc 2 lần qua màng lọc cellulose acetat kích thước lỗ lọc 0,2 µm. Do nồng độ curcumin bão hòa trong nước quá thấp, không thể xác định được bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis hay HPLC nên phương pháp LC-MS/MS được lựa chọn với các điều kiện tham khảo tài liệu kết hợp với khảo sát sơ bộ như sau :
Các thông số phần sắc ký lỏng: cột sắc ký XBridge (75 mm x 2,1 mm; 2,5µm). Pha động: acetonitril : dung dịch acid formic 0,05%/nước (tỉ lệ 6:4). Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút. Thể tích tiêm mẫu: 10µl. Nhiệt độ buồng cột: 300C.
Các thông số của detector khối phổ: chế độ ion hóa ESI (+), nhiệt độ nguồn ion 5000C, năng lượng bắn phá 22 V, năng lượng khí phụ trợ N2 với tốc độ 1000 l/giờ, ion ban đầu m/z = 369,0, ion tạo thành m/z = 177,0
Chuẩn bị mẫu chuẩn curcumin có nồng độ 0,2 µg/ml bằng cách pha loãng từ dung dịch gốc ở mục 2.3.1.2. Tính toán kết quả bằng cách so sánh đáp ứng pic của mẫu thử và mẫu chuẩn.
Phương pháp đánh giá độ hòa tan của curcumin
Mức độ và tốc độ hòa tan của curcumin nguyên liệu được xác định bằng phép thử độ hòa tan với các điều kiện cụ thể như sau:
Thiết bị: máy cánh khuấy, tốc độ quay 100 vòng/phút
Môi trường hòa tan: 900 ml nước chứa 0,2% Tween 80
Nhiệt độ môi trường hòa tan: 37 ± 0,5oC
Khối lượng mẫu thử: tương ứng với 5,0 mg curcumin
Cách tiến hành: cho các mẫu thử vào cốc có mỏ chứa một lượng môi trường thử độ hòa tan, siêu âm 3-4 giây và chuyển vào cốc chứa môi trường thử hòa tan. Sau các khoảng thời gian 10, 20, 30, 40, 50 và 60 phút, lấy khoảng 10 ml dung dịch thử, ly tâm 5 phút với tốc độ 12000 vòng/phút. Phần dịch trong được định lượng curcumin bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis ở bước sóng 427 nm, sử dụng mẫu trắng là dung dịch Tween 80 0,2%. Sau khi đo quang, rót toàn bộ phần cắn và phần dịch ly tâm vào cốc thử độ hòa tan.
Chuẩn bị mẫu trắng và mẫu chuẩn. Tính toán kết quả bằng cách so sánh độ hấp thụ của mẫu thử và mẫu chuẩn:
Cn = (Dn / Do) x Co
Trong đó Cn, Co: nồng độ dung dịch thử và chuẩn (µg/ml)
Dn, Do: độ hấp thụ của dung dịch thử và chuẩn
Phần trăm curcumin đã hòa tan tại thời điểm t được tính theo công thức:
% CUR = (Cn x 900)/ (m x 1000 ) x 100%.
Cn: nồng độ curcumin tại thời điểm t (µg/ml) m : lượng curcumin thử (mg)
Mỗi mẫu thử được tiến hành 3 lần và lấy kết quả trung bình.
Nghiên cứu độ ổn định hóa học của curcumin ở trạng thái rắn
Các mẫu nguyên liệu curcumin được theo dõi ở các điều kiện khắc nhiệt như sau:
Lọ thủy tinh mở ở điều kiện ẩm và nhiệt trong 7 và 14 ngày (độ ẩm 75 ± 5%, nhiệt độ 40 ± 2oC).
Lọ thủy tinh mở ở điều kiện độ ẩm cao 90%, nhiệt độ phòng (sử dụng dung dịch bão hòa kali nitrat để tạo môi trường có độ ẩm cao) trong 7 ngày.
Lọ thủy tinh đậy nút cao su và chụp nắp nhôm ở điều kiện nhiệt khô 60oC
trong 7 ngày.
Tác động cơ học bằng cách nghiền bi trong buồng nghiền với bi inox 6 giờ Đánh giá thay đổi hình thức bên ngoài bằng cảm quan và xác định lại hàm lượng curcumin so với ban đầu bằng phương pháp HPLC theo mục 2.3.2.1.g.
Nghiên cứu tương tác dược chất-tá dược
Tương tác dược chất-tá dược được đánh giá bằng cách phối hợp dược chất và tá dược Tween 80, Tween 60, Cremophor RH40, Poloxame 188, poly vinylpyrolidon (PVP), PVA, manitol, Trehalose, lactose theo tỷ lệ 1:1 hoặc với tá dược CMC, Na CMC theo tỷ lệ 5:1.
Đối với các chất diện hoạt thể chất lỏng như Tween 80, Tween 60, Cremophor RH40, tiến hành nghiền ướt 1g curcumin với tá dược theo tỷ lệ trên để tạo bột nhão. Đối với các polyme và chất mang thân nước, ngâm trương nở hoặc hòa tan trong 1- 2 ml nước tạo dung dịch, lấy một lượng dung dịch tương ứng theo tỷ lệ trên và nghiền ướt với 1 g curcumin tạo bột nhão.
Bột nhão hoặc hỗn hợp vật lý được đóng vào các lọ thủy tinh và bảo quản ở nhiệt độ 40 ± 2oC và độ ẩm 75 ± 5 % trong 1 tháng, ở trạng thái mở và đóng nắp (đậy nút cao su, chụp nắp nhôm). Sau thời gian theo dõi, đánh giá thay đổi về hình thức bên ngoài của các lọ mở nắp. Riêng đối với các lọ đóng nắp, đánh giá hình thức bên ngoài và hàm lượng curcumin bằng phương pháp HPLC.