Phương Nam Co LTD
© 20/4/2024 - Vietnam12h.com Application

Nano artesunat bào chế từ PEG tween 80 Bào chế tiểu phân nano artesunat sử dụng PLGA và Polyethylene glycol PEG bằng phương pháp nhũ hóa - bốc hơi dung môi Phương pháp bào chế hỗn dịch nano ART/PLGA –Polyethylene glycol PEG Dựa vào các nghiên cứu của Boix-garriga và cộng sự [30], Ferenz và cộng sự [64], Garinot và cộng sự [70], tiến hành kết hợp 2 dạng PLGA và copolyme diblock PLGA-Polyethylene glycol PEG (sau đây gọi tắt là PLGA-PEG) để có tỷ lệ PEG phù hợp. Tiểu phân ART/PLGA-Polyethylene glycol PEG được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa và bốc hơi dung môi. Cụ thể, PLGA, PLGA-Polyethylene glycol PEG (từ 10 - 100% so với tổng lượng polymer PLGA là 50 mg) và dược chất artesunat (10% - 50% so với tổng lượng polyme) được hòa tan trong 5 ml dicloromethan (DCM) . Hỗn hợp sau đó được nhỏ giọt từ từ bằng micropipet vào dung dịch Tween 80 (0,5% - 2,0%) , đồng nhất bằng siêu âm (Sonics & Materials, Inc., Mỹ) ở công suất 100 W trong 5 phút (nhịp xung bằng 0) , duy trì nhiệt độ 5 - 10oC bằng bể nước đá bên ngoài kết hợp khuấy từ. Nhũ tương thu được tiếp tục được khuấy từ trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Hỗn dịch nano sau đó được tinh chế bằng một trong hai cách sau: ly tâm sử dụng ống ly tâm có gắn màng siêu lọc hoặc sử dụng cột lọc tiếp tuyến. Phương pháp tinh chế hỗn dịch nano ART/PLGA –Polyethylene glycol PEG Mục đích quá trình tinh chế là giảm thể tích và làm sạch hỗn dịch (loại bớt nước, artesunat dạng phân tử tự do, Tween 80) trước khi đông khô. Tiến hành tinh chế hỗn dịch bằng một trong hai cách sau: Cách 1: Sử dụng ống ly tâm gắn màng siêu lọc kích thước 10-50 kDa, tốc độ ly tâm 5000 vòng/phút (2879 g) trong 30 phút, nhiệt độ 10oC. Lực ly tâm sẽ đẩy nước kéo theo các chất tan qua màng lọc, phần cắn còn lại trên bề mặt màng lọc chứa TP nano ART/PLGA-Polyethylene glycol PEG. Cách 2: Sử dụng cột lọc tiếp tuyến có màng lọc kích thước 50 kDa (Cột polystyren 50kDa, MicroKros, SpectrumLabs, loại chưa tiệt khuẩn ký hiệu C02- S050-05-N) . Hỗn dịch được bơm tuần hoàn qua cột với tốc độ 70 vòng/phút kết hợp điều chỉnh áp suất cột bằng cách di chuyển con lăn. Áp suất trong lòng cột sẽ đẩy nước kéo các chất tan thấm qua màng lọc theo chiều vuông góc với dòng chảy, TP nano ART/PLGA-PEG không đi qua màng sẽ liên tục chạy qua cột. Quy trình tinh chế bằng cột lọc tiếp tuyến được thực hiện tiếp tục đến khi thu được khoảng 15 ml hỗn dịch đặc như hình 2.3. Thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa công thức Bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm được thiết kế thường quy hoặc dựa vào mô hình thích hợp nhờ việc sử dụng phần mềm MODDE 8.0 (Umetrics Inc, Mỹ) . Phân tích và tối ưu hóa Tiến hành xác định các yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa công thức nano chứa artesunat bằng phương pháp phân tích mặt đáp. Đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat KTTP và phân bố KTTP Nguyên tắc: KTTP được xác định bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động. Chiếu 1 chùm tia laser vào các hạt có kích thước khác nhau sẽ thu được mức độ tán xạ ánh sáng khác nhau. Bằng cách đo cường độ ánh sáng tán xạ có thể xác định được KTTP trung bình. Tiến hành: TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) sau khi ly tâm màng và rửa 2 lần bằng nước cất được phân tán vào một lượng nước cất vừa đủ (10 ml) sao cho chỉ số đếm (count rates) nằm trong khoảng 200-400 kcps. Tiến hành đo mẫu trên máy Zetasizer NanoZS90, sử dụng cuvet nhựa. Thế zeta Nguyên tắc: Khi đặt 1 điện trường lên hệ, tiểu phân sẽ di chuyển về phía điện cực trái dấu với vận tốc tỷ lệ với thế zeta. Tốc độ này được xác định dựa vào việc phân tích chuyển động của tiểu phân thông qua ánh sáng tán xạ. Thế zeta được xác định dựa vào độ nhớt môi trường và định luật Smoluchowski - Huckel. Tiến hành: tương tự như phương pháp xác định kích thước tiểu phân với cuvet nhựa có 2 lá điện cực bằng đồng với chỉ số đếm nằm trong khoảng 200-400 kcps. Hình thái cấu trúc tiểu phân Sử dụng kính hiển vi điện tử quét SEM Nguyên tắc: Dùng chùm điện tử quét trên bề mặt mẫu nghiên cứu. Việc tạo ảnh được thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ sự tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật. Tiến hành: Pha loãng hỗn dịch đặc chứa TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) polyme 50 lần, nhỏ trên giấy nhôm. Để khô bề mặt giấy nhôm ở nhiệt độ phòng. Sau đó quan sát mẫu bằng kính hiển vi điện tử quét JEOL JSM-7600F (JEOL Ltd., Nhật Bản) hoặc NanoSEM 450 (FEI Corp., Mỹ) hoặc Hitachi S-4800 (Nhật) . Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Nguyên tắc: Một chùm electron hội tụ có năng lượng cao được truyền đến mẫu có bề dày siêu mỏng. Tương tác giữa các điện tử và mẫu có 2 kiểu là đàn hồi và không đàn hồi. Trong tương tác đàn hồi, điện tử không bị mất năng lượng. Trong tương tác không đàn hồi, điện tử mất một phần năng lượng và tạo ra nhiều tín hiệu như: điện tử thứ cấp, điện tử Auger, tia X, tia khả kiến. Các electron truyền được qua mẫu cũng xuất hiện cùng lúc này. Do sự giảm năng lượng của electron phụ thuộc chủ yếu vào mật độ và độ dày của mẫu nên các điện tử truyền qua này tạo nên ảnh hai chiều của mẫu phân tích. Tiến hành: Hỗn dịch nano được nhỏ lên lưới đồng được bao với màng phim carbon, nhuộm với acid phosphotungstic 2% và để khô ở nhiệt độ phòng trước khi quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM H7600, Nhật Bản) ở điện thế 100kV [152]. Phân tích phổ nhiễu xạ tia X Các mẫu bột chứa các thành phần trong công thức, hỗn hợp vật lý (tỉ lệ các thành phần tương tự như công thức thu được sau khi bào chế) hoặc công thức bào chế được nghiền mịn, sau đó được trải đều trên một bộ phận giữ mẫu. Tiến hành đo phổ nhiễu xạ tia X của các mẫu bằng nhiễu xạ kế tia X D8 ADVANCE (Bruker, Đức) với bước sóng tia X lấy từ bức xạ Kα của đồng (1,5406Ǻ) [128]. Phân tích phổ hồng ngoại Thành phần hóa học và tương tác vật lý giữa polyme, các tá dược khác và artesunat được xác định bằng phổ hồng ngoại (FT-IR) . Các mẫu bột chứa các thành phần trong công thức, hỗn hợp vật lý (tỉ lệ các thành phần tương tự như công thức thu được sau khi bào chế) hoặc công thức bào chế được nghiền mịn, rồi tiếp tục được nghiền trộn với bột viên kali bromid. Sau đó, các mẫu được ép thành viên mỏng và được quét trong vùng từ 550-4000 cm-1 sử dụng thiết bị phân tích hồng ngoại Jasco FT-IR 6700 (Nhật Bản) . Phân tích phổ 1H-NMR TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) ART/PLGA-PEG được bào chế theo phương pháp như ở mục 2.4.1.2 nhưng không sử dụng chất diện hoạt Tween 80 để tránh kết quả ―dương tính giả‖ vì nhóm -OCH2- trong PLGA-PEG cũng tồn tại trong phân tử Tween 80, sau đó được tiến hành đông khô. Phân tán bột nano đông khô vào dung môi CDCl3, D2O rồi tiến hành đo phổ 1H-NMR trên máy Bruker AscendTM 500 [61]. Định lượng Qua tham khảo tài liệu [1], [2], [126], [156], và qua các khảo sát sơ bộ, tiến hành định lượng artesunat trong các mẫu thử bằng phương pháp HPLC với các điều kiện sắc ký như sau: + Pha động: ACN – đệm phosphat pH 3,0 (45:55, tt/tt) (hòa tan 1,36g KH2PO4 vào 1000 ml nước cất, điều chỉnh tới pH 3,0 bằng acid phosphoric đặc) . Lọc qua màng lọc nylon kích thước lỗ lọc 0,45µm. + Cột InertSustain C18 (250 × 4,6 mm, 5,0 µm, GL Sciences Inc., Nhật Bản) . + Thể tích tiêm mẫu 50 µl. + Tốc độ dòng 1,0 ml/phút. + Detector DAD, bước sóng 210 nm. Hiệu suất nano hóa và khả năng nạp thuốc Xác định hàm lượng dược chất tự do sử dụng ống ly tâm gắn màng 10kDa (MWCO 10 kDa, Millipore, Mỹ) . Hút chính xác 2 ml hỗn dịch nano, ly tâm ở 4500 vòng/phút (2332 g) trong 30 phút. Lấy phần dịch trong bên dưới màng lọc, sau đó tiến hành sắc ký HPLC với các điều kiện như mục 2.4.2.7. Hàm lượng dược chất tổng được định lượng bằng cách pha loãng mẫu với ACN, lắc đều, đậy kín và siêu âm trong 15 phút, ngoài ra, dung dịch acid acetic còn được sử dụng để hòa tan lớp CS. Rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm, sau đó tiến hành sắc ký với các điều kiện tương tự. Hiệu suất nano hóa (EE) và khả năng nạp thuốc (LC) được tính theo công thức như đã đề cập ở mục 1.2.4.6. [126], [168]. Tiểu phân được hóa rắn bằng cách đông khô các hỗn dịch nano hoặc thu được mẫu rắn có sẵn sau khi bào chế tiểu phân nano bằng phương pháp phun điện trường. Khả năng giải phóng thuốc in vitro Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc in vitro được tiến hành sử dụng túi thẩm tích (với thông số MWCO 10 kDa, Membra-Cel, Mỹ) chứa một thể tích nhất định hỗn dịch nano artesunat (2-3 ml) . Túi thẩm tích được giữ cố định bằng hai kẹp nhựa rồi đặt trong ống ly tâm 50 ml chứa 10 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,8 hoặc pH 7,4 (để đảm bảo điều kiện ―sink‖) . Ống ly tâm được đặt trong bể lắc điều nhiệt (Julabo, Đức) ở nhiệt độ 37 ± 0,5oC với tốc độ 100 vòng/phút. Sau từng thời điểm nhất định, 1 ml thể tích môi trường bên ngoài túi thẩm tích được hút để định lượng hàm lượng dược chất giải phóng và thay thế bằng một thể tích môi trường tương ứng [126]. Nồng độ artesunat ban đầu trong hỗn dịch đặc được xác định như sau: hút chính xác 1 ml hỗn dịch đặc vào bình định mức 10 ml. Thêm ACN, lắc đều, đậy kín và siêu âm trong 15 phút. Bổ sung ACN vừa đủ đến vạch, lắc đều. Nồng độ artesunat trong hỗn dịch được xác định theo phương pháp HPLC như mục 2.4.2.7. Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 20,0 mg ARTESUNAT chuẩn cho vào bình định mức 10 ml, thêm dung môi pha loãng (hỗn hợp dung môi ACN và nước với tỉ lệ 9:1, tt/tt) , lắc đều cho tan hết, bổ sung dung môi pha loãng cho đủ thể tích. Hút chính xác 1 ml dung dịch vừa tạo thành cho vào bình định mức 10 ml, bổ sung dung môi pha loãng cho đủ thể tích. Nồng độ artesunat ở thời điểm thứ t được tính theo công thức Ct= S_t.C_c/ S_c Trong đó: C_t, C_c là nồng độ artesunat trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn (µg/ml) ; St, Sc là diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn (mAu.s) Khối lượng artesunat đã giải phóng ra môi trường tại thời điểm thứ t được tính theo công thức: m_t= C_t×V + ∑_i=1^t-1 C_i Trong đó: m_t Tổng lượng artesunat đã giải phóng ra môi trường hòa tan tại thời điểm thứ t (μg) mt C_t: Nồng độ artesunat trong môi trường thử tại thời điểm thứ t (μg/ml) V: Thể tích môi trường khuếch tán (ml) V’: Thể tích mỗi lần lấy mẫu thử (ml) Phần trăm giải phóng tại thời điểm t được xác định bằng công thức: Trong đó: % ART giải phóng = (m_t /m_o) x100% m_t là khối lượng dược chất đã giải phóng tại thời điểm thứ t (μg) m_olà khối lượng dược chất ban đầu đưa vào trong túi thẩm tích (μg) Phân tích động học giải phóng Dữ liệu giải phóng dược chất được đưa vào các mô hình toán học khác nhau nhằm làm rõ hơn cơ chế giải phóng dược chất. Tiêu chuẩn lựa chọn mô hình phù hợp nhất để mô tả quá trình giải phóng được sử dụng là dựa trên hệ số xác định (coefficient of determination) R2 để đánh giá tính phù hợp của mô hình. Để so sánh các mô hình có số tham số khác nhau, hệ số xác định hiệu chỉnh (adjusted coefficient of determination) R²_adjusted được sử dụng: R²_adjusted= 1- [(n-1)/n-p)](1-R²) Trong đó: n: Số điểm dữ liệu giải phóng. p: Số tham số của mô hình. Mô hình phù hợp nhất là mô hình có giá trị R²_adjusted lớn nhất. Hệ số AIC (Akaike information criterion) cũng được sử dụng để lựa chọn mô hình giải phóng phù hợp. Với cùng một tập dữ liệu giải phóng, mô hình có giá trị AIC nhỏ nhất được xem là mô hình phù hợp nhất. AIC được tính theo công thức sau: AIC =n xln(WSSR) + 2 x p Trong đó: n: Số điểm dữ liệu giải phóng. p: Số tham số của mô hình. WSSR: tổng bình phương phần dư có trọng số.Hệ số AIC được sử dụng để kiểm tra khả năng áp dụng của các mô hình giải phóng. Các giá trị AIC và các hệ số khác như k, n, ... trong các mô hình này được tính toán dựa vào phần bổ trợ trong Excel là DDSolver để mô hình hóa và so sánh các dữ kiện hòa tan. kythuat

Nano artesunat bào chế từ PEG tween 80

Bào chế tiểu phân nano artesunat sử dụng PLGA và Polyethylene glycol PEG bằng phương pháp nhũ hóa - bốc hơi dung môi

Phương pháp bào chế hỗn dịch nano ART/PLGA –Polyethylene glycol PEG

Dựa vào các nghiên cứu của Boix-garriga và cộng sự [30], Ferenz và cộng sự [64], Garinot và cộng sự [70], tiến hành kết hợp 2 dạng PLGA và copolyme diblock PLGA-Polyethylene glycol PEG (sau đây gọi tắt là PLGA-PEG) để có tỷ lệ PEG phù hợp.

Tiểu phân ART/PLGA-Polyethylene glycol PEG được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa và bốc hơi dung môi. Cụ thể, PLGA, PLGA-Polyethylene glycol PEG (từ 10 - 100% so với tổng lượng polymer PLGA là 50 mg) và dược chất artesunat (10% - 50% so với tổng lượng polyme) được hòa tan trong 5 ml dicloromethan (DCM) . Hỗn hợp sau đó được nhỏ giọt từ từ bằng micropipet vào dung dịch Tween 80 (0,5% - 2,0%) , đồng nhất bằng siêu âm (Sonics & Materials, Inc., Mỹ) ở công suất 100 W trong 5 phút (nhịp xung bằng 0) , duy trì nhiệt độ 5 - 10oC bằng bể nước đá bên ngoài kết hợp khuấy từ. Nhũ tương thu được tiếp tục được khuấy từ trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Hỗn dịch nano sau đó được tinh chế bằng một trong hai cách sau: ly tâm sử dụng ống ly tâm có gắn màng siêu lọc hoặc sử dụng cột lọc tiếp tuyến.

Phương pháp tinh chế hỗn dịch nano ART/PLGA –Polyethylene glycol PEG

Mục đích quá trình tinh chế là giảm thể tích và làm sạch hỗn dịch (loại bớt nước, artesunat dạng phân tử tự do, Tween 80) trước khi đông khô. Tiến hành tinh chế hỗn dịch bằng một trong hai cách sau:

Cách 1: Sử dụng ống ly tâm gắn màng siêu lọc kích thước 10-50 kDa, tốc độ ly tâm 5000 vòng/phút (2879 g) trong 30 phút, nhiệt độ 10oC. Lực ly tâm sẽ đẩy nước kéo theo các chất tan qua màng lọc, phần cắn còn lại trên bề mặt màng lọc chứa TP nano ART/PLGA-Polyethylene glycol PEG.

Cách 2: Sử dụng cột lọc tiếp tuyến có màng lọc kích thước 50 kDa (Cột polystyren 50kDa, MicroKros, SpectrumLabs, loại chưa tiệt khuẩn ký hiệu C02- S050-05-N) . Hỗn dịch được bơm tuần hoàn qua cột với tốc độ 70 vòng/phút kết hợp điều chỉnh áp suất cột bằng cách di chuyển con lăn. Áp suất trong lòng cột sẽ đẩy nước kéo các chất tan thấm qua màng lọc theo chiều vuông góc với dòng chảy, TP nano ART/PLGA-PEG không đi qua màng sẽ liên tục chạy qua cột. Quy trình tinh chế bằng cột lọc tiếp tuyến được thực hiện tiếp tục đến khi thu được khoảng 15 ml hỗn dịch đặc như hình 2.3.

Thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa công thức

Bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm được thiết kế thường quy hoặc dựa vào mô hình thích hợp nhờ việc sử dụng phần mềm MODDE 8.0 (Umetrics Inc, Mỹ) .

Phân tích và tối ưu hóa

Tiến hành xác định các yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa công thức nano chứa artesunat bằng phương pháp phân tích mặt đáp.

Đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat

KTTP và phân bố KTTP

Nguyên tắc: KTTP được xác định bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động. Chiếu 1 chùm tia laser vào các hạt có kích thước khác nhau sẽ thu được mức độ tán xạ ánh sáng khác nhau. Bằng cách đo cường độ ánh sáng tán xạ có thể xác định được KTTP trung bình.

Tiến hành: TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) sau khi ly tâm màng và rửa 2 lần bằng nước cất được phân tán vào một lượng nước cất vừa đủ (10 ml) sao cho chỉ số đếm (count rates) nằm trong khoảng 200-400 kcps. Tiến hành đo mẫu trên máy Zetasizer NanoZS90, sử dụng cuvet nhựa.

Thế zeta

Nguyên tắc: Khi đặt 1 điện trường lên hệ, tiểu phân sẽ di chuyển về phía điện cực trái dấu với vận tốc tỷ lệ với thế zeta. Tốc độ này được xác định dựa vào việc phân tích chuyển động của tiểu phân thông qua ánh sáng tán xạ. Thế zeta được xác định dựa vào độ nhớt môi trường và định luật Smoluchowski - Huckel.

Tiến hành: tương tự như phương pháp xác định kích thước tiểu phân với cuvet nhựa có 2 lá điện cực bằng đồng với chỉ số đếm nằm trong khoảng 200-400 kcps.

Hình thái cấu trúc tiểu phân

Sử dụng kính hiển vi điện tử quét SEM

Nguyên tắc: Dùng chùm điện tử quét trên bề mặt mẫu nghiên cứu. Việc tạo ảnh được thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ sự tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật.

Tiến hành: Pha loãng hỗn dịch đặc chứa TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) polyme 50 lần, nhỏ trên giấy nhôm. Để khô bề mặt giấy nhôm ở nhiệt độ phòng. Sau đó quan sát mẫu bằng kính hiển vi điện tử quét JEOL JSM-7600F (JEOL Ltd., Nhật Bản) hoặc NanoSEM 450 (FEI Corp., Mỹ) hoặc Hitachi S-4800 (Nhật) .

Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Nguyên tắc: Một chùm electron hội tụ có năng lượng cao được truyền đến mẫu có bề dày siêu mỏng. Tương tác giữa các điện tử và mẫu có 2 kiểu là đàn hồi và không đàn hồi. Trong tương tác đàn hồi, điện tử không bị mất năng lượng. Trong tương tác không đàn hồi, điện tử mất một phần năng lượng và tạo ra nhiều tín hiệu như: điện tử thứ cấp, điện tử Auger, tia X, tia khả kiến. Các electron truyền được qua mẫu cũng xuất hiện cùng lúc này. Do sự giảm năng lượng của electron phụ thuộc chủ yếu vào mật độ và độ dày của mẫu nên các điện tử truyền qua này tạo nên ảnh hai chiều của mẫu phân tích.

Tiến hành: Hỗn dịch nano được nhỏ lên lưới đồng được bao với màng phim carbon, nhuộm với acid phosphotungstic 2% và để khô ở nhiệt độ phòng trước khi quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM H7600, Nhật Bản) ở điện thế 100kV [152].

Phân tích phổ nhiễu xạ tia X

Các mẫu bột chứa các thành phần trong công thức, hỗn hợp vật lý (tỉ lệ các thành phần tương tự như công thức thu được sau khi bào chế) hoặc công thức bào chế được nghiền mịn, sau đó được trải đều trên một bộ phận giữ mẫu. Tiến hành đo phổ nhiễu xạ tia X của các mẫu bằng nhiễu xạ kế tia X D8 ADVANCE (Bruker, Đức) với bước sóng tia X lấy từ bức xạ Kα của đồng (1,5406Ǻ) [128].

Phân tích phổ hồng ngoại

Thành phần hóa học và tương tác vật lý giữa polyme, các tá dược khác và artesunat được xác định bằng phổ hồng ngoại (FT-IR) . Các mẫu bột chứa các thành phần trong công thức, hỗn hợp vật lý (tỉ lệ các thành phần tương tự như công thức thu được sau khi bào chế) hoặc công thức bào chế được nghiền mịn, rồi tiếp tục được

nghiền trộn với bột viên kali bromid. Sau đó, các mẫu được ép thành viên mỏng và được quét trong vùng từ 550-4000 cm-1 sử dụng thiết bị phân tích hồng ngoại Jasco FT-IR 6700 (Nhật Bản) .

Phân tích phổ 1H-NMR

TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) ART/PLGA-PEG được bào chế theo phương pháp như ở mục 2.4.1.2 nhưng không sử dụng chất diện hoạt Tween 80 để tránh kết quả ―dương tính giả‖ vì nhóm -OCH2- trong PLGA-PEG cũng tồn tại trong phân tử Tween 80, sau đó được tiến hành đông khô. Phân tán bột nano đông khô vào dung môi CDCl3, D2O rồi tiến hành đo phổ 1H-NMR trên máy Bruker AscendTM 500 [61].

Định lượng

Qua tham khảo tài liệu [1], [2], [126], [156], và qua các khảo sát sơ bộ, tiến hành định lượng artesunat trong các mẫu thử bằng phương pháp HPLC với các điều kiện sắc ký như sau:

+ Pha động: ACN – đệm phosphat pH 3,0 (45:55, tt/tt) (hòa tan 1,36g KH2PO4 vào 1000 ml nước cất, điều chỉnh tới pH 3,0 bằng acid phosphoric đặc) . Lọc qua màng lọc nylon kích thước lỗ lọc 0,45µm.

+ Cột InertSustain C18 (250 × 4,6 mm, 5,0 µm, GL Sciences Inc., Nhật Bản) .

+ Thể tích tiêm mẫu 50 µl.

+ Tốc độ dòng 1,0 ml/phút.

+ Detector DAD, bước sóng 210 nm.

Hiệu suất nano hóa và khả năng nạp thuốc

Xác định hàm lượng dược chất tự do sử dụng ống ly tâm gắn màng 10kDa (MWCO 10 kDa, Millipore, Mỹ) . Hút chính xác 2 ml hỗn dịch nano, ly tâm ở 4500 vòng/phút (2332 g) trong 30 phút. Lấy phần dịch trong bên dưới màng lọc, sau đó tiến hành sắc ký HPLC với các điều kiện như mục 2.4.2.7. Hàm lượng dược chất tổng được định lượng bằng cách pha loãng mẫu với ACN, lắc đều, đậy kín và siêu âm trong 15 phút, ngoài ra, dung dịch acid acetic còn được sử dụng để hòa tan lớp CS. Rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm, sau đó tiến hành sắc ký với các điều kiện tương tự.

Hiệu suất nano hóa (EE) và khả năng nạp thuốc (LC) được tính theo công thức như đã đề cập ở mục 1.2.4.6. [126], [168]. Tiểu phân được hóa rắn bằng cách đông

khô các hỗn dịch nano hoặc thu được mẫu rắn có sẵn sau khi bào chế tiểu phân nano bằng phương pháp phun điện trường.

Khả năng giải phóng thuốc in vitro

Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc in vitro được tiến hành sử dụng túi thẩm tích (với thông số MWCO 10 kDa, Membra-Cel, Mỹ) chứa một thể tích nhất định hỗn dịch nano artesunat (2-3 ml) . Túi thẩm tích được giữ cố định bằng hai kẹp nhựa rồi đặt trong ống ly tâm 50 ml chứa 10 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,8 hoặc pH 7,4 (để đảm bảo điều kiện ―sink‖) . Ống ly tâm được đặt trong bể lắc điều nhiệt (Julabo, Đức) ở nhiệt độ 37 ± 0,5oC với tốc độ 100 vòng/phút. Sau từng thời điểm nhất định, 1 ml thể tích môi trường bên ngoài túi thẩm tích được hút để định lượng hàm lượng

dược chất giải phóng và thay thế bằng một thể tích môi trường tương ứng [126].

Nồng độ artesunat ban đầu trong hỗn dịch đặc được xác định như sau: hút chính xác 1 ml hỗn dịch đặc vào bình định mức 10 ml. Thêm ACN, lắc đều, đậy kín và siêu âm trong 15 phút. Bổ sung ACN vừa đủ đến vạch, lắc đều. Nồng độ artesunat trong hỗn dịch được xác định theo phương pháp HPLC như mục 2.4.2.7.

Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 20,0 mg ARTESUNAT chuẩn cho vào bình định mức 10 ml, thêm dung môi pha loãng (hỗn hợp dung môi ACN và nước với tỉ lệ 9:1, tt/tt) , lắc đều cho tan hết, bổ sung dung môi pha loãng cho đủ thể tích. Hút chính xác 1 ml dung dịch vừa tạo thành cho vào bình định mức 10 ml, bổ sung dung môi pha loãng cho đủ thể tích.

Nồng độ artesunat ở thời điểm thứ t được tính theo công thức

Ct= S_t.C_c/ S_c

Trong đó: C_t, C_c là nồng độ artesunat trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn (µg/ml) ; St, Sc là diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn (mAu.s)

Khối lượng artesunat đã giải phóng ra môi trường tại thời điểm thứ t được tính theo công thức:

m_t= C_t×V + ∑_i=1^t-1 C_i

Trong đó: m_t Tổng lượng artesunat đã giải phóng ra môi trường hòa tan tại thời điểm thứ t (μg) mt

C_t: Nồng độ artesunat trong môi trường thử tại thời điểm thứ t (μg/ml)

V: Thể tích môi trường khuếch tán (ml)

V’: Thể tích mỗi lần lấy mẫu thử (ml)

Phần trăm giải phóng tại thời điểm t được xác định bằng công thức:

Trong đó:

% ART giải phóng = (m_t /m_o) x100%

m_t là khối lượng dược chất đã giải phóng tại thời điểm thứ t (μg)

m_olà khối lượng dược chất ban đầu đưa vào trong túi thẩm tích (μg)

Phân tích động học giải phóng

Dữ liệu giải phóng dược chất được đưa vào các mô hình toán học khác nhau nhằm làm rõ hơn cơ chế giải phóng dược chất.

Tiêu chuẩn lựa chọn mô hình phù hợp nhất để mô tả quá trình giải phóng được sử dụng là dựa trên hệ số xác định (coefficient of determination) R2 để đánh giá tính phù hợp của mô hình. Để so sánh các mô hình có số tham số khác nhau, hệ số xác định hiệu chỉnh (adjusted coefficient of determination) R²_adjusted được sử dụng:

R²_adjusted= 1- [(n-1)/n-p)](1-R²)

Trong đó: n: Số điểm dữ liệu giải phóng.

p: Số tham số của mô hình.

Mô hình phù hợp nhất là mô hình có giá trị R²_adjusted lớn nhất.

Hệ số AIC (Akaike information criterion) cũng được sử dụng để lựa chọn mô hình giải phóng phù hợp. Với cùng một tập dữ liệu giải phóng, mô hình có giá trị AIC nhỏ nhất được xem là mô hình phù hợp nhất. AIC được tính theo công thức sau:

AIC =n xln(WSSR) + 2 x p

Trong đó: n: Số điểm dữ liệu giải phóng.

p: Số tham số của mô hình.

WSSR: tổng bình phương phần dư có trọng số.Hệ số AIC được sử dụng để kiểm tra khả năng áp dụng của các mô hình giải phóng. Các giá trị AIC và các hệ số khác như k, n, ... trong các mô hình này được tính toán dựa vào phần bổ trợ trong Excel là DDSolver để mô hình hóa và so sánh các dữ kiện hòa tan.

kythuat