Bào chế bột đông khô chứa tiểu phân nano artesunat
Công thức của nano ART/PLGA-Polyethylene glycol PEG thu được sau khi tiến hành tối ưu hóa được tiếp tục bào chế dưới dạng bột đông khô. Cụ thể, tiến hành bào chế 250 ml hỗn dịch nano (5 lần x 50 ml/1 lần) theo quy trình bào chế TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) đã đề cập ở mục 2.4.1.2. Hỗn dịch nano sau khi tinh chế bằng ống ly tâm màng hay cột lọc tiếp tuyến được xác định hàm lượng bằng HPLC (như phần định lượng ở mục 2.4.2.7) , rồi phối hợp với các dung dịch gốc của tá dược tạo bánh như manitol, fructose, lactose, saccarose để có các nồng độ tá dược tạo bánh khác nhau (thêm nước cất để đủ thể tích nếu cần) với hàm lượng dược chất tương đương 2 mg/ml.
Tiến hành đông khô trên máy đông khô Christ Alpha 1-LD với các thông số cụ thể như sau: thời gian tiền đông (ở -70oC) là 12 giờ, thời gian sấy khô sơ cấp là 24- 48 giờ, điều kiện vận hành của máy đông khô với thông số cố định của model 1-LD là -48 ± 2oC; 0,120 ± 0,02 mbar, quy mô khoảng 6 lọ mỗi lần đông khô. Sau đó, tiến hành đóng nút cao su, nắp nhôm và bảo quản.
Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 20 mg
Bột đông khô pha tiêm chứa TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) artesunat được bào chế với các thông số công thức và quy trình tốt nhất được rút ra từ quá trình bào chế bột đông khô đã đề cập ở mục 2.4.3.1. Tiến hành bào chế bột đông khô pha tiêm theo quy trình bào chế vô khuẩn.
Tiệt khuẩn tất cả các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong bào chế bằng các phương pháp thích hợp.
Hầu hết các công đoạn pha chế đều được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn ở tủ an toàn sinh học cấp II (Streamline SC2 Class II Biological Safety Cabinets, Esco Technologies, Inc., Mỹ) .
Khu vực ngoài tủ an toàn sinh học cấp II được xử lý bằng ethanol 70o và bật đèn UV 6-8 giờ trước khi tiến hành pha chế.
Pha dầu chứa dược chất ART, PLGA, PLGA-Polyethylene glycol PEG và diclorometan sẽ được lọc loại khuẩn bằng màng lọc PTFE có kích thước lỗ lọc 0,2 μm (Finetech, Đài Loan) .
Pha nước chứa chất diện hoạt Tween 80, dung dịch chứa tá dược tạo bánh được lọc loại khuẩn bằng màng lọc RC 0,2 µm (Regenerated cellulose syringe filter, Sartorius, Đức) .
Phối hợp pha dầu vào pha nước dưới tác dụng của siêu âm đầu dò tạo nhũ tương, sau đó bốc hơi dung môi để thu được hỗn dịch nano (quy trình tương tự quá trình bào chế TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) ART/PLGA-Polyethylene glycol PEG ở mục 2.4.1.3) . Tinh chế hỗn dịch nano để loại bớt nước, dược chất tự do và chất diện hoạt. Xác định hàm lượng của ART.
Đóng chính xác một thể tích nhất định hỗn dịch chứa TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) artesunat sau khi tinh chế vào lọ thủy tinh trung tính thể tích 20 ml đã xử lý. Phối hợp với các dung dịch gốc của tá dược tạo bánh như manitol, fructose, lactose, saccarose,... để có các nồng độ tá dược tạo bánh khác nhau (thêm nước cất để đủ thể tích nếu cần) với hàm lượng dược chất tương đương 2 mg/ml. Đậy hờ bằng nút cao su có xẻ rãnh ở phần dưới của nút.
Chuyển các lọ vào tủ lạnh sâu -70oC trong 12 giờ.
Chuyển sản phẩm đã đông lạnh hoàn toàn vào thiết bị đông khô. Các thông số cụ thể của quá trình đông khô này được rút ra từ quá trình tối ưu hóa quy trình bào chế bột đông khô đã đề cập ở mục 2.4.3.1.
Khi sản phẩm đã khô hoàn toàn, một bộ phận ép cơ học sẽ đẩy các nút cao su làm đóng kín các lọ tại chỗ ngay trong buồng đông khô.
Cuối cùng, lấy sản phẩm ra khỏi buồng đông khô và siết nắp nhôm, hoàn thiện thành phẩm.
Đánh giá các đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat
Tính chất của bánh thuốc trước khi phân tán lại
Thử bằng cảm quan: về màu sắc, độ xốp, sự co ngót,... của bánh đông khô.
Tính chất của bánh thuốc sau khi phân tán lại
Thử bằng cảm quan: màu sắc, khả năng lắng cặn, độ đồng nhất của hỗn dịch sau
khi pha.
KTTP và PDI của tiểu phân sau khi đông khô
Bột đông khô sau khi phân tán lại bằng nước cất 2 lần và tiến hành pha mẫu và đo KTTP tương tự các bước ở phần đo KTTP và phân bố KTTP của TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) ARTESUNAT như đã đề cập ở mục 2.4.2.1.
Hình thái của tiểu phân sau khi sau khi đông khô
Hỗn dịch sau khi phân tán lại được tiến hành ly tâm bằng ống ly tâm gắn màng siêu lọc kích thước 10 kDa, tốc độ ly tâm 5000 vòng/phút (2879 g) trong 30 phút, nhiệt độ 10oC trên máy ly tâm lạnh (Hermle Labortechnik GmbH, Đức) . Sau đó, tiến hành rửa cắn 3 lần với 3 ml nước/lần để loại tá dược tạo bánh. Hỗn dịch cuối cùng được sử dụng để đo hình thái tiểu phân bằng phương pháp kính hiển vi điện tử quét SEM như đề cập ở mục 2.4.2.3.
pH của hỗn dịch sau khi pha lại
Thấm ướt và phân tán lại chế phẩm với 5 ml nước cất hai lần theo thành của lọ chứa bột đông khô, sau đó, tiến hành lắc nhẹ trong khoảng 1 phút để đảm bảo rã và phân tán hoàn toàn bánh đông khô. Tiến hành đo pH theo DĐVN IV – PL. 6.2 [1].
Độ đồng đều khối lượng
Loại bỏ hết nhãn, rửa sạch và làm khô bên ngoài. Loại bỏ hết các đai nhôm và nút nếu có, cân ngay khối lượng cả vỏ và thuốc. Lấy hết thuốc ra, dùng bông lau sạch, rửa với nước, sau đó với ethanol 96 %, sấy ở 100-105 °C trong 1 giờ. Để nguội trong bình hút ẩm và cân. Hiệu số giữa hai lần cân là khối lượng của thuốc. Tiến hành tương tự với 19 đơn vị khác lấy ngẫu nhiên. Tính khối lượng trung bình của thuốc [1].
Định lượng
Bột đông khô sau khi phân tán lại bằng nước cất 2 lần trong bình định mức 10 ml, rồi pha loãng 10 lần bằng ACN, tiếp tục lắc kỹ. Sau đó, tiến hành lọc qua màng lọc nylon 0,45µm rồi tiến hành sắc ký HPLC với các điều kiện như đã trình bày trong mục 2.4.2.7.
Thẩm định một số tiêu chí của phương pháp định lượng:
Chuẩn bị
+ Dung môi pha loãng: Là hỗn hợp dung môi ACN và nước với tỉ lệ 9:1.
+ Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 20,0 mg ARTESUNAT chuẩn hòa tan trong 5 ml dung môi pha loãng, chuyển vào bình định mức 25 ml, thêm dung môi pha loãng đến vạch, lắc kỹ được dung dịch chuẩn gốc nồng độ 800 µg/ml. Tiến hành pha loãng để được các dung dịch chuẩn với các nồng độ khác nhau.
+ Dung dịch thử: Các mẫu thử sau khi phân tán lại bằng nước cất hai lần trong bình định mức 10 ml, tiến hành pha loãng 10 lần bằng dung môi ACN để đạt nồng độ của dung dịch thử khoảng 200 µg/ml.
Tiến hành
+ Tính phù hợp hệ thống
Tiêm mẫu chuẩn có nồng độ 200 µg/ml lặp lại 6 lần qua hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn. Yêu cầu độ lặp lại về diện tích pic, thời gian lưu giữa mỗi lần tiêm có giá trị RSD không quá 2% và hệ số bất đối xứng trong khoảng 0,8-1,5.
+ Độ đặc hiệu
Chuẩn bị mẫu artesunat chuẩn (200 µg/ml) , mẫu thử chứa TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) artesunat bào chế theo quy trình lựa chọn (200 µg/ml) và mẫu trắng bằng cách bào chế mẫu thử không chứa dược chất với quy trình tương tự.
Tiến hành tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã lựa chọn và ghi lại các sắc ký đồ. Yêu cầu pic của artesunat được nhận diện rõ trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử và không xuất hiện pic lạ tại thời điểm trùng với thời gian lưu của artesunat trên sắc ký đồ của mẫu trắng.
+ Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Chuẩn bị một dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 12,5 đến 400 µg/ml. Tiêm lần lượt các dung dịch vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn. Xác định mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ART.
+ Độ đúng
Tiến hành bào chế mẫu trắng không chứa dược chất tương tự như quy trình bào chế mẫu chứa dược chất. Bổ sung một lượng ARTESUNAT chuẩn vào các mẫu trắng trên để thu được 03 mẫu chuẩn có hàm lượng tương ứng 80%, 100%, 120% so với hàm lượng ghi trên nhãn (20 mg) . Tiến hành pha loãng các mẫu chuẩn này bằng dung môi pha loãng như trên để được các nồng độ tương ứng khoảng 160, 200, 240 µg/ml. Lọc các dung dịch này qua màng lọc kích thước lỗ lọc 0,45 µm. Tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn. Yêu cầu phần trăm tìm lại của các mẫu ở 3 mức nồng độ nằm trong khoảng từ 98-102% [68], [82].
+ Độ chính xác
Chuẩn bị 6 mẫu dung dịch thử có nồng độ artesunat khoảng 200 µg/ml và chạy sắc ký theo chương trình đã lựa chọn. Xác định nồng độ dung dịch từ phương trình hồi quy tuyến tính. Yêu cầu độ lặp lại về hàm lượng artesunat trong các mẫu có giá trị RSD không vượt quá 2%.
Hàm ẩm
Tiến hành theo phương pháp Karl-Fischer theo DĐVN IV với thuốc thử Karl Fischer sử dụng Aquastar Titrant 5 và Aquastar Solvent (Merck) . Cân chính xác 0,3g chế phẩm, rồi chuyển nhanh vào cốc chuẩn độ chứa thuốc thử và điện cực. Tiến hành chuẩn độ và ghi nhận kết quả [1].
Đánh giá hiệu suất nano hóa
Tiến hành phân tán bột đông khô pha tiêm chứa TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) ART/PLGA-Polyethylene glycol PEG bằng 5 ml nước cất. Sau đó, chuyển hỗn dịch thu được vào bình định mức 10 ml, bổ sung nước cất đến vạch. Các bước tiến hành tiếp theo để xác định hiệu suất nano hóa tương tự như đề cập ở mục 2.4.2.8.
Tạp chất liên quan
Tiến hành theo cách sau:
- Phương pháp sắc ký lớp mỏng:
Bản mỏng: Silicagel G đã hoạt hóa ở 120 oC trong 30 phút. Dung môi khai triển: Ethyl acetat - toluen (1 : 1) .
Dung dịch thử: Tiến hành phân tán lại bột thuốc bằng 5 ml hỗn hợp dung môi gồm nước cất và ACN (tỉ lệ 1:9) , sau đó chuyển vào bình định mức 10 ml và bổ sung hỗn hợp dung môi này đến vạch. Lọc qua màng lọc 0,45 µm thu được dung dịch thử.
Dung dịch đối chiếu (1) : Chứa 0,2 mg dihydroartemisinin trong 1 ml ACN. Dung dịch đối chiếu (2) : Chứa 0,1 mg dihydroartemisinin trong 1 ml ACN. Dung dịch đối chiếu (3) : Chứa 10,0 mg artesunat chuẩn trong 1 ml ACN.
Cách tiến hành:
Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 l mỗi dung dịch trên, riêng đối với dung dịch thử tiến hành chấm 5 lần. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được 15 cm, lấy bản mỏng ra để khô ngoài không khí, phun lên bản mỏng dung dịch vanilin 2 % trong acid sulfuric (TT) . Sấy ở 105 oC trong 10 phút và quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng ban ngày.
Đọc kết quả:
Trên sắc ký đồ của dung dịch thử, ngoài vết chính tương ứng với vết artesunat của dung dịch đối chiếu (3) , vết DHA phải không được đậm màu hơn vết DHA của dung dịch đối chiếu (1) .
Và trên sắc ký đồ của dung dịch thử, không được quá một vết phụ có màu đậm hơn màu của vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) .
Độ vô khuẩn
Thử theo phương pháp cấy trực tiếp (theo chuyên luận ―Thử vô khuẩn‖ ghi trong phụ lục 13.7 của Dược điển Việt Nam IV) . Cụ thể, tiến hành phân tán bột đông khô bằng 5 ml nước cất pha tiêm. Hút chính xác 1 ml hỗn dịch sau khi phân tán cấy trực tiếp vào 200 ml môi trường Fluid Thioglycolat và môi trường Soyabean Casein Digest đã chuẩn bị sẵn, lắc đều. Tiến hành ủ môi trường, theo dõi và đánh giá kết quả sau 14 ngày [1].
Tồn dư dung môi
Tiến hành bằng phương pháp sắc khí khí với kỹ thuật tiêm pha hơi tĩnh và detector ion hóa ngọn lửa theo chuyên luận ―Xác định dung môi tồn dư‖ ghi trong phụ lục 10.14 của Dược điển Việt Nam IV) [1].
Phân tích phổ nhiễu xạ tia X
Các mẫu bột chứa các thành phần trong công thức, hỗn hợp vật lý (tỉ lệ các thành phần tương tự như công thức thu được sau khi bào chế) hoặc công thức bào chế được nghiền mịn, sau đó được trải đều trên một bộ phận giữ mẫu. Tiến hành đo tương tự như các bước đã đề cập ở mục 2.4.2.4.
Phân tích phổ hồng ngoại
Các mẫu bột chứa các thành phần trong công thức, hỗn hợp vật lý (tỉ lệ các thành phần tương tự như công thức thu được sau khi bào chế) hoặc công thức bào chế được nghiền mịn, rồi tiếp tục được nghiền trộn với bột viên kali bromid. Tiến hành đo bằng phổ hồng ngoại tương tự như đã đề cập ở mục 2.4.2.5.
Phân tích nhiệt vi sai (DSC)
Các mẫu bột (gồm các thành phần trong công thức, hỗn hợp vật lý (tỉ lệ các thành phần tương tự như công thức thu được sau khi bào chế) , bột đông khô được nghiền mịn) được đặt trong đĩa nhôm đậy nắp kín với khối lượng 3,0-8,0 mg. Phép phân tích nhiệt được thực hiện với nhiệt độ quét trong phạm vi từ 30oC đến 200oC và tốc độ gia nhiệt 10oC/phút.
Đánh giá khả năng giải phóng dược chất in vitro
Tiến hành phân tán bột đông khô pha tiêm chứa TP nano chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) ART/PLGA-PEG bằng 5 ml nước cất. Sau đó, chuyển hỗn dịch thu được vào bình định mức 10 ml, bổ sung nước cất đến vạch. Khả năng giải phóng dược chất in vitro của bột đông khô pha tiêm cũng được tiến hành tương tự như các bước đã đề cập ở mục 2.4.2.9 với túi thẩm tích (10kDa – Membra-Cel, Mỹ) chứa 5 ml hỗn dịch nano ART/PLGA-PEG. Túi thẩm tích được đặt vào ống ly tâm loại 50 ml có chứa 20 ml dung dịch salin đệm phosphat pH 6,8 hoặc 7,4 [45].