Phương Nam Co LTD
© 28/7/2021 - Vietnam12h.com Application

Tween 80, PEG 400 nghiên cứu in vitro

Đánh giá giải phóng thuốc trực tiếp trong môi trườngTween 80

Một số công trình nghiên cứu đã sử dụng phương pháp in vitro để khảo sát sơ bộ xu hướng giải phóng Curcumin từ hệ nano trước khi thử in vivo. Môi trường thử là 900 ml dung dịch natri laurylsulfat 1% hoặc Tween 80 0,05% bằng thiết bị cánh khuấy với tốc độ khuấy và thời gian thử thích hợp ở nhiệt độ 37 ± 0,5oC. Cá biệt, có nghiên cứu sử dụng một loạt môi trường thử độ hòa tan khác nhau như môi trường acid hydrocloric 0,1 M (pH 1,0), đệm phosphat pH 4,0, 6,8 và 7,4 chứa 0,5% Tween 80 . Mẫu thử được đưa trực tiếp vào môi trường hoặc đưa vào viên nang cứng gelatin và đặt vào môi trường thử độ hòa tan. Mẫu lấy ra sau từng khoảng thời gian xác định được ly tâm 15000 vòng/phút . Đánh giá lượng DC giải phóng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis , quang phổ huỳnh quang với bước sóng kích thích và phát xạ lần lượt 430 và 550 nm hoặc HPLC .

Ngoài ra, một số nghiên cứu sử dụng thiết bị thử là các ống Eppendorf chứa môi trường thử và mẫu thử , . Các ống được đặt vào thiết bị lắc và duy trì nhiệt độ 37 ± 0,5oC với tốc độ phù hợp. Sau từng khoảng thời gian xác định, lấy các ống ra và ly tâm. Phân tán trở lại trong dung môi thích hợp để xác định lượng curcumin giải phóng bằng phương pháp HPLC .

Theo Xie X. và cộng sự, sự giải phóng in vitro của hệ tiểu phân nano PLGA chứa curcumin được tiến hành trong hai môi trường đệm phosphat pH 2,0 và 7,4, mô phỏng dịch dạ dày và ruột. Kết quả đánh giá khả năng giải phóng cho thấy: curcumin giải phóng nhanh trong 8 giờ đầu và tiếp tục giải phóng kéo dài. Tuy nhiên, tốc độ giải phóng của curcumin từ tiểu phân nano trong dịch ruột cao hơn dịch dạ dày nhân tạo do sự hấp thu chủ yếu của curcumin xảy ra ở ruột . Sự giải phóng in vitro curcumin chậm và kéo dài dẫn đến hấp thu in vivo kéo dài.

Đánh giá giải phóng thuốc qua túi thẩm tích

Một số nghiên cứu sử dụng túi thẩm tích với kích thước lỗ xốp cho tiểu phân có khối lượng phân tử khoảng 3-14 kDa đi qua. Do curcumin ít tan trong nước nên môi trường khuếch tán có thể là ethanol hoặc dịch dạ dày nhân tạo (dung dịch muối đệm phosphat điều chỉnh về pH 2,0 bằng acid hydrocloric) và dịch ruột nhân tạo (dung dịch muối đệm phosphat ở pH 7,4) chứa 0,1% Tween 80 (kl/tt). Vai trò của Tween 80 để làm tăng độ tan của curcumin trong dung dịch đệm và tránh bám dính curcumin vào thành ống . Một số nghiên cứu sử dụng môi trường khuếch tán là dung dịch PEG 400 30% hoặc dung dịch natri laurylsulfat 20% .

Túi thẩm tích được đặt trong môi trường ở nhiệt độ 37 ± 0,5oC và sử dụng khuấy từ với tốc độ khuấy thích hợp , hoặc đặt trong giỏ quay của thiết bị hòa tan hoặc được rung lắc theo chiều ngang bằng thiết bị rung . Định lượng DC giải phóng qua màng sau từng khoảng thời gian bằng phương pháp HPLC hoặc quang phổ UV-Vis ở bước sóng 423 nm .

Theo Ji H. và cộng sự, sự giải phóng curcumin từ hệ tiểu phân nano lipid rắn được tiến hành bằng phương pháp sử dụng túi thẩm tích trong môi trường dịch dạ dày nhân tạo (pH 1,2) và dịch ruột nhân tạo (pH 7,4). Kết quả cho thấy: tốc độ giải phóng chậm trong cả hai môi trường chứng tỏ curcumin được nạp bên trong lõi lipid với tỷ lệ cao .

Đánh giá tính thấm qua tế bào Caco-2

Theo nghiên cứu của Yu H. và Huang Q., màng tế bào Caco-2 mô phỏng biểu mô ruột non được sử dụng để nghiên cứu cơ chế thấm của nhũ tương nano chứa curcumin. Nhũ tương nano có thể thấm theo hai cơ chế: thứ nhất, nhũ tương nano bị tiêu hóa bởi lipase, đồng thời, curcumin được hòa tan bởi acid béo-muối mật tạo micel. Do đó, curcumin hòa tan khuếch tán thụ động qua màng tế bào biểu mô. Thứ hai, hệ nano nhũ tương với kích thước giọt nhỏ có thể khuếch tán trực tiếp qua màng ruột. Kết quả đánh giá tính thấm qua màng tế bào Caco-2 chỉ ra rằng: cơ chế thấm của nhũ tương nano chứa curcumin chủ yếu theo con đường khuếch tán-tiêu hóa .

Nghiên cứu in vitro có ưu điểm đơn giản, ít tốn kém, dễ thiết lập, tính toán kết quả nhanh và thường được dùng là công cụ xây dựng công thức hoặc để kiểm soát chất lượng, đảm bảo độ đồng nhất của sản phẩm, lô mẻ và nhà sản xuất. Nghiên cứu in vitro để thăm dò, sàng lọc trước khi chuyển sang nghiên cứu in vivo và có thể thay thế cho in vivo nếu chứng minh được có sự tương quan đồng biến. Mặc dù vậy, do curcumin có độ tan thấp, chuyển hóa và thải trừ nhanh trong cơ thể sống nên việc sử dụng mô hình đánh giá in vitro để dự đoán in vivo thường khó chính xác.

Trong số các phương pháp đánh giá in vitro nêu trên, phương pháp đánh giá giải phóng trực tiếp từ môi trường là mô hình phù hợp để đánh giá độ hòa tan của nano tinh thể. Phương pháp giải phóng in vitro qua túi thẩm tích do sử dụng màng thẩm tích có thể tạo ra hàng rào đối với quá trình hòa tan, do đó làm chậm tốc độ hòa tan. Vì vậy, phương pháp này không thích hợp trong đánh giá độ hòa tan mà chỉ phù hợp với các tiểu phân nano kiểm soát giải phóng. Ngoài ra, các nghiên cứu in vitro trên màng tế bào Caco-2 có hữu ích trong việc đánh giá tính thấm và cơ chế thấm.

Mặc dù vậy, việc đánh giá độ hòa tan của nano tinh thể bằng phương pháp thử giải phóng trực tiếp trong môi trường cũng gặp phải một số khó khăn nhất định. Curcumin là DC sơ nước, khó phân tán vào môi trường nước, có thể bị kết tụ và bám dính thành cốc và cánh khuấy. Khi chuyển sang dạng nano tinh thể, hiện tượng kết tụ vẫn có thể xảy ra do tác động của nhiều yếu tố của quá trình phun sấy. Do đó, tốc độ hòa tan tại một số thời điểm ban đầu có thể chậm do tiểu phân nano chưa thấm và nổi trên bề mặt môi trường hòa tan. Tại mỗi thời điểm sau khi lấy mẫu, một lượng tiểu phân trong môi trường thử có thể bị kéo theo. Do đó, để xác định được phần trăm curcumin hòa tan cần sử dụng biện pháp thích hợp để loại các tiểu phân DC kích cỡ nanomet không tan từ mẫu.

Nghiên cứu ex vivo

Một số nghiên cứu về SKD của curcumin sử dụng phương pháp nghiên cứu ex vivo để đánh giá hấp thu của curcumin trên ruột cô lập.

Theo Kumar A. và cộng sự, mô hình túi ruột lộn ex vivo có thể được sử dụng là công cụ để nghiên cứu cơ chế và động học của hấp thu thuốc. Trong nghiên cứu này, chuột được cho nhịn đói 10-12 giờ, uống nước tự do và gây mê bằng ether. Rạch đường giữa bụng, toàn bộ phần ruột được lấy ra, đặt vào dung dịch Krebs Ringer (pH 7,4) và được cung cấp oxy. Phần tá tràng được sử dụng trong nghiên cứu tính thấm, thắt bằng chỉ nilon ở một đầu và lộn ra bởi một que thủy tinh. Dung dịch Krebs Ringer bên ngoài túi ruột được coi như dịch nhày và dung dịch bên trong coi như dịch ruột. Lượng curcumin thấm qua ruột sau từng khoảng thời gian xác định được xác định bằng phương pháp HPLC .

Theo nghiên cứu của Gupta N. K. và Dixit V. K., phương pháp đánh giá hấp thu ex vivo của nhũ tương nano chứa curcumin được tiến hành trên ruột dê. Kết quả cho thấy: hấp thu ex vivo của phức hợp curcumin và phospholipid cao hơn so với curcumin tự do .

Nghiên cứu ex vivo có ưu điểm đơn giản hơn so với nghiên cứu in vivo. Mô hình nghiên cứu này có thể sử dụng để nghiên cứu cơ chế và động học quá trình hấp thu của thuốc trước khi được phân bố và chuyển hóa trong cơ thể. Tuy nhiên, đối với DC chuyển hóa mạnh qua gan thành một số chất có hoạt tính như curcumin, mô hình này chưa phản ánh đúng quá trình sinh dược học và dược động học của cơ thể sống.

Nghiên cứu in situ

Bên cạnh các mô hình nghiên cứu trên, nghiên cứu in situ được đề cập đến trong nhiều nghiên cứu nhằm đánh giá đặc tính hấp thu của curcumin.

Trong nghiên cứu của Cui J. và cộng sự, đặc tính hấp thu của hệ tự nhũ hóa chứa curcumin được đánh giá bằng phương pháp truyền vào ruột in situ. Chuột thí nghiệm được cho nhịn đói 12 giờ và gây mê. Toàn bộ phần ruột non được bộc lộ, buộc dây truyền và đưa ống thông dò bằng plastic vào cơ thể. Phần ống thông dò được rửa bằng dung dịch nước muối sinh lý, gắn vào mô hình chứa một cái bơm nhu động và xi lanh chứa dung dịch mẫu. Ruột non được giữ nhẹ nhàng để duy trì cung cấp máu, dung dịch thử được truyền qua ruột một cách tuần hoàn. Sau từng khoảng xác định, lấy ra dung dịch thử. Mẫu được xử lý và phân tích bằng phương pháp HPLC .

Sự hấp thu qua ruột của hệ nano lipid rắn được Ji H. và cộng sự đánh giá bằng phương pháp thử khuếch tán in situ. Đồng thời, phương pháp này cũng đánh giá được cơ chế tăng tính thấm thông qua ức chế P-gp của hệ nano lipid rắn sử dụng các chất diện hoạt Brij 78 và TPGS . Tương tự, Xie X. và cộng sự cũng sử dụng nghiên cứu in situ để đánh giá khả năng thấm của curcumin từ hệ tiểu phân nano PLGA qua ruột và khả năng ức chế P-gp . Sự hấp thu của hỗn dịch nano curcumin trong hệ thống dạ dày ruột của chuột cống cũng được nghiên cứu theo mô hình nghiên cứu in situ bởi Gao Y. và cộng sự. Hỗn dịch nano curcumin được hấp thu theo cơ chế khuếch tán thụ động với 9,20% curcumin được hấp thu trong 2 giờ. Vùng hấp thu chủ yếu của curcumin trong đường tiêu hóa chuột cống là tá tràng và hỗng tràng

Mô hình in situ dùng trong nghiên cứu cơ thế thấm hoặc khuếch tán qua màng tế bào ruột. Giống như mô hình ex vivo, mô hình in situ chưa phản ánh các giai đoạn đầy đủ của quá trình sinh dược học và dược động học của cơ thể sống.

Nghiên cứu in vivo

Nghiên cứu in vivo dựa trên việc đánh giá nồng độ thuốc trong huyết tương sau khi uống. Một số nghiên cứu về SKD của curcumin còn định lượng cả curcumin trong máu và lượng curcumin còn lại trong hệ thống dạ dày ruột chưa được hấp thu hoặc định lượng cả phần curcumin bài tiết qua phân .

Do khả năng thấm kém, độ tan thấp, bị chuyển hóa và thải trừ nhanh trong cơ thể nên các mẫu huyết tương thường có nồng độ curcumin rất thấp. Vì vậy, trong nghiên cứu đánh giá SKD của các dạng thuốc chứa curcumin cần lựa chọn đối tượng thử và phương pháp định lượng curcumin trong huyết tương cần có độ nhạy cao.

Về đối tượng thử, nghiên cứu SKD đường uống của curcumin được tiến hành trên chuột cống , , , hoặc chuột nhắt , , , . Bên cạnh đó cũng có một số nghiên cứu được thực hiện trên người tình nguyện . Nghiên cứu trên chuột có ưu điểm là đơn giản hơn nghiên cứu trên người tình nguyện về khía cạnh đạo đức, pháp lý và kinh tế. Chuột và người có nhiều điểm tương tự về hấp thu và mô hình biểu thị sự vận chuyển tương tự ở ruột non nhưng mức độ biểu thị và mô hình enzym chuyển hóa ở dạ dày ruột có thể khác nhau . Bộ gen của chuột và người giống nhau đến 99%. Chuột cũng là một loài động vật có vú, dễ sinh sản và rẻ tiền hơn so với các loại động vật khác. Đồng thời, chuột là động vật dễ nuôi nhốt và bắt giữ bằng tay và sự khác biệt về gen thấp, dẫn đến sai khác về phạm vi đáp ứng hẹp hơn so với các động vật thí nghiệm khác . Nhược điểm của việc sử dụng chuột trong nghiên cứu in vivo là sự khác nhau cơ bản giữa người và chuột về con đường và tốc độ chuyển hóa. Việc cho chuột uống thuốc khó khăn hơn trên người, thể tích dịch sinh học ít và lấy mẫu khó khăn .

Các nghiên cứu đánh giá SKD in vivo đều cho chuột uống mẫu tiểu phân nano curcumin bằng ống thông vào dạ dày. Các mẫu máu được lấy ra sau từng khoảng thời gian xác định từ tĩnh mạch đuôi chuột , hoặc lấy máu từ đám rối hốc mắt chuột sau khi gây mê bằng ether , , có thể lấy bằng cách chọc vào tim ,. Máu thu được trộn với thành phần chống đông (heparin hoặc EDTA ) bằng cách lắc và ly tâm thu lấy phần huyết tương. Trong một số trường hợp không thể lấy mẫu nhiều lần trên một cá thể, có thể lấy mẫu trên một nhóm cá thể hoặc sử dụng mô hình dược động học quần thể.

Về xử lý mẫu, mẫu huyết tương được chiết bằng dung môi ethyl acetat , methanol , ethanol hoặc tert-butyl methyl ether . Ly tâm lấy dịch trong. Bốc hơi dung môi trong dòng khí nitrogen ở nhiệt độ thích hợp. Phần cắn hòa tan vào methanol và tiến hành phân tích.

Mẫu huyết tương sau khi xử lý được định lượng curcumin bằng phương pháp thích hợp , , . Cá biệt có một số nghiên cứu định lượng cả curcumin và chất chuyển hóa của curcumin trong huyết tương , . Chất chuyển hóa của curcumin có thể ở dưới dạng tự do hoặc liên hợp dạng glucuronid hoặc sulfat. Khi đó, mẫu huyết tương được ủ với dung dịch enzym sulfatase và glucuronidase ở 37oC trong 1 giờ để chuyển curcumin sulfat và glucuronid thành curcumin tự do trước khi chiết .

Về phương pháp định lượng, hầu hết các nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC với ưu điểm nhanh, đơn giản, có độ nhạy cao. Điều kiện tiến hành định lượng curcumin trong dịch sinh học bằng phương pháp HPLC trong các nghiên cứu về cơ bản là sử dụng cột C18 ở nhiệt độ thích hợp. Thành phần pha động thường là các dung môi phân cực như acetonitril, methanol phối hợp với nước. Tốc độ dòng thường từ 1 đến 2 ml/phút. Phần lớn các nghiên cứu sử dụng detector tử ngoại bước sóng từ 420-430 nm hoặc detector huỳnh quang với bước sóng kích thích và phát xạ lần lượt 426 và 536 nm hoặc detector khối phổ. Một số nghiên cứu sử dụng chất chuẩn nội như β-17-estradiol acetat , , benzocain hoặc emodin . Bên cạnh đó, một số nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp với khối phổ LC-MS hoặc LC-MS/MS .

So với các mô hình nghiên cứu SKD khác, nghiên cứu in vivo cung cấp được các yếu tố thể hiện sự phản ứng của cơ thể sống với thuốc. Từ đó có thể dự đoán được các tác dụng, lựa chọn đường dùng, liều dùng trên người. Đánh giá SKD in vivo là cơ sở lựa chọn thuốc điều trị thay thế. Tuy nhiên, nghiên cứu in vivo có hạn chế giá thành cao, tốn thời gian và hạn chế về mặt đạo đức sinh học.

Gao Y. và cộng sự đã đánh giá SKD của hỗn dịch nano curcumin trên chuột nhắt với liều 250 mg/kg. Các thông số dược động học tính toán không dựa trên mô hình ngăn trên hai nhóm cá thể, mỗi nhóm gồm 27 chuột. Giá trị AUC0∞ của hỗn dịch nano khoảng 617,82 ± 70,92 g/ml.giờ, gấp 6,80 lần so với hỗn dịch curcumin (90,12 ± 16,85 g/l.giờ). Cmax đối với hỗn dịch nano curcumin khoảng 174,75 ± 49,05 ng/ml, cao hơn so với hỗn dịch curcumin (12,58 ± 4,28 ng/ml) (p < 0,01) .

Dựa trên cơ sở phân tích trên, để giải quyết vấn đề tăng SKD của curcumin, nghiên cứu lựa chọn bào chế dưới dạng hệ tiểu phân nano bằng phương pháp giảm kích thước tiểu phân sử dụng kỹ thuật nghiền bi siêu mịn kết hợp với đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn. Trong điều kiện tiến hành thực nghiệm, nghiên cứu lựa chọn các điều kiện thử in vitro với thiết bị thử kiểu cánh khuấy và mẫu thử được đưa trực tiếp vào môi trường hòa tan. Phương pháp đánh giá SKD in vivo dựa trên việc xác định nồng độ curcumin trong huyết tương chuột nhắt. Do curcumin bị chuyển hóa mạnh thành nhiều chất chuyển hóa, trong đó có tetrahydrocurcumin và nồng độ các chất này đều thấp nên các phương pháp định lượng nồng độ thuốc trong huyết tương được lựa chọn cần đáp ứng được cả yêu cầu độ nhạy, độ chính xác cao. Do đó, phương pháp LC-MS/MS được lựa chọn.