Thiết kế thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm theo phương pháp chéo đôi, ngẫu nhiên đơn liều mô phỏng theo mô hình thử TĐSH của FDA [129]. Chó được nuôi và theo dõi ổn định trước khi đưa vào thí nghiệm 3 ngày, nhịn đói 24 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm.
06 chó đực khoẻ mạnh, cân nặng 10 - 12 kg được chia thành 2 nhóm ngẫu nhiên với 2 giai đoạn thử như sau:
Bố trí thí nghiệm đánh giá SKD- Giai đoạn 1: Nhóm 1 được uống thuốc đối chiếu (Gastevin), mỗi chó trong nhóm uống 1 viên nang thuốc đối chiếu chứa pellet Lansoprazol bao tan ở ruột hàm lượng 30 mg với 100 ml nước. Nhóm 2 được uống thuốc thử, mỗi chó trong nhóm uống 1 viên nang chứa pellet lansoprazol bao tan ở ruột hàm lượng 30 mg bào chế được với 100 ml nước.
- Giai đoạn 2: Tiến hành ngược lại giai đoạn 1, nhóm 1 được uống thuốc thử và nhóm 2 được uống thuốc đối chiếu. Giai đoạn 2 được tiến hành sau giai đoạn 1 là 3 ngày.
- Cách cho chó uống thuốc: Đặt cố định chó lên bàn, dùng thanh cứng bằng gỗ đặt ngang miệng chó. Sử dụng kẹp đưa viên thuốc vào sâu trong cổ họng chó, cho chó uống 100 ml nước để chó nuốt viên thuốc vào dạ dày.
Phương pháp lấy mẫu
Tiến hành lấy mẫu tại thời điểm ngay trước khi cho chó uống thuốc và tại các thời điểm sau khi uống thuốc 0,5; 1; 1,5; 2; 2,25; 2,5; 2,75; 3; 3,5; 4; 6; 8; 10; 12 và 24 giờ. Mỗi điểm lấy khoảng 3 ml máu tĩnh mạch cổ cho vào ống nghiệm có tráng sẵn chất chống đông heparin, lắc nhẹ, ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 7 phút, hút lấy phần huyết tương. Mẫu huyết tương được bảo quản ở -450C đến khi phân tích.
Định lượng Lansoprazol và điều chỉnh PH bằng triethanolamine tea 99%
Xử lý mẫu huyết tương và định lượng Lansoprazol trong huyết tương bằng phương pháp sau: Thêm vào 500 µl huyết tương 50 µl dung dịch chuẩn nội làm việc PPZ có nồng độ 40 µg/ml (được pha loãng ngay trước khi sử dụng từ dung dịch chuẩn nội gốc có nồng độ khoảng 1 mg/ml bằng MeOH), lắc xoáy trong 30 giây, thêm 2 ml tert- butyl methyl ether, lắc xoáy trong 3 phút, ly tâm ở 200C với tốc độ 4500 vòng/phút trong 10 phút. Hút 1,0 ml lớp dung môi hữu cơ, bốc hơi tới khô trong máy cô quay chân không ở 300C, cắn được hoà tan trong 80 µl ACN, thêm 120 µl dung dịch đệm kali dihydrophosphat 0,01 M (đã được điều chỉnh pH về 8,0 bằng triethanolamine tea 99% sản xuất tại Thái Lan do Phương Nam cung cấp “triethanolamine tea”, trộn đều. Tiêm 50 µl dung dịch này vào hệ thống sắc ký. Định lượng Lansoprazol trong huyết tương chó dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính về sự phụ thuộc giữa tỷ lệ diện tích pic giữa Lansoprazol và PPZ với nồng độ Lansoprazol được xây dựng.
Phương pháp HPLC trên đã được thẩm định, có tính đặc hiệu và chọn lọc cao. Khoảng nồng độ tuyến tính từ 0,05 đến 3,0 µg/ml với R2 lớn hơn 0,9990. Giới hạn định lượng dưới được xác định là 0,05 µg/ml. Độ đúng trong ngày và giữa các ngày (3 ngày) từ 97,50 % đến 101,68 %, độ lặp lại tốt. Các dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở ngăn mát tủ lạnh (nhiệt độ từ 2- 80C) có sự sai khác lớn nhất với nồng độ ban đầu là -1,30 %. Các mẫu huyết tương được nghiên cứu độ ổn định trong các điều kiện khác nhau, khi bảo quản ở -450C sau thời gian 30 ngày thì nồng độ sai khác so với thời điểm ban đầu lớn nhất là 2,20 %. Hiệu suất chiết Lansoprazol ra khỏi huyết tương cao (thấp nhất là 97,67 % và cao nhất là 101,02 %) và ổn định [82].
Phương pháp xác định một số thông số dược động học
- Cmax và Tmax: Thu được trực tiếp từ thí nghiệm.
- AUC0-t (diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian từ thời điểm 0 đến thời điểm t) được tính theo phương pháp hình thang với t là thời điểm lấy mẫu cuối cùng có thể định lượng được.
- AUC0-∞ (diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian từ thời điểm 0 đến vô cùng) được tính theo công thức:
AUC0-∞ = AUC0-t + AUCt-∞
AUCt-∞ = Ct / λz
Trong đó:Ct: Nồng độ của thuốc tại thời điểm lấy mẫu cuối cùng.
λz: Độ dốc đường cong ở phần cuối đường biểu diễn theo quy tắc hình thang.
Các thông số AUC0-t, AUC0-∞ được tính toán bằng phần mềm Winolin 5.2 dựa trên các dữ liệu thu được từ nồng độ thuốc tại các thời điểm.
Phương pháp so sánh các thông số dược động học
- Sử dụng phương pháp “khoảng tin cậy 90 %” theo quy định của FDA [129] để so sánh các thông số dược động học như AUC0- t, AUC0-∞, Cmax của thuốc thử và thuốc đối chiếu (số liệu chuyển qua dạng logarit).
Tính khoảng tin cậy 90 % được tính theo công thức sau:
CI = µT - µR ± t 0,1;n ´ S
Trong đó :CI: Khoảng tin cậy 90 %.
µT, µR: Giá trị trung bình của thuốc thử và thuốc đối chiếu.
t 0,1;n: Giá trị tra bảng Student t - test.
S: Căn bậc hai trung bình bình phương của sai số ngẫu nhiên phân tích từ phương sai của thiết kế.
N: Tổng các đối tượng thử trong thiết kế thí nghiệm chéo đôi.
Hai chế phẩm được coi là tương đương nếu CI nằm trong khoảng từ 80 % đến 125 % [130], [131], [132], sử dụng phần mềm WinNonlin 5.2.
- Sử dụng phương pháp kiểm định phi tham số (kiểm định Wilcoxon dấu xếp hạng) để so sánh Tmax của hai chế phẩm.