tween polysorbate 80 hóa chất hoạt động bề mặt<

Phương Nam Co LTD
Cung cấp chất hoạt động bề mặt, dầu bôi trơn Korea
© 2/5/2024 - Vietnam12h.com Application

Định lượng axit chenodeoxycholic và axit mật tự nhiên: Một phương pháp phân tích toàn diện Axit mật đóng vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa và hấp thụ chất béo từ thức ăn cũng như vitamin tan trong chất béo. Việc định lượng các axit mật này là cực kỳ quan trọng để hiểu về vai trò của chúng trong các quá trình sinh lý cũng như tác động của chúng đối với nhiều tình trạng bệnh lý khác nhau. Bài viết này trình bày chi tiết về phương pháp định lượng axit chenodeoxycholic (CDCA) và các axit mật tự nhiên khác bằng cách sử dụng phương pháp LC-MS/MS đã được thiết lập tốt với những điều chỉnh nhỏ. Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu này dựa trên phương pháp đã được công bố trước đó, với các điều chỉnh được tinh chỉnh để tăng độ chính xác và độ nhạy. Dưới đây là các bước chi tiết trong quá trình định lượng axit mật, bao gồm việc chuẩn bị dung dịch chuẩn, chiết xuất mẫu, phân tách sắc ký, phân tích khối lượng qua phổ khối phổ, và xử lý dữ liệu. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và chuẩn hiệu chỉnh Bước đầu tiên trong quá trình định lượng là chuẩn bị các dung dịch chuẩn của các vật liệu tham chiếu. Mỗi axit mật đã được cân và hòa tan riêng lẻ trong methanol, lấy vào cân nhắc đến hình thức muối và độ tinh khiết được chỉ định trong chứng chỉ phân tích. Các dung dịch chuẩn này được lưu trữ ở nhiệt độ -20°C trong suốt thời gian nghiên cứu. Các mẫu chuẩn hiệu chỉnh mới được chuẩn bị kỹ lưỡng ở chín nồng độ khác nhau từ 1 đến 1000 ng/mL cho mỗi loạt phân tích. Ngoài ra, các mẫu kiểm soát chất lượng ở ba nồng độ (15, 400 và 800 ng/mL) cũng được bao gồm để đảm bảo tính đáng tin cậy của phương pháp phân tích. Đáng chú ý rằng tất cả các dung dịch chuẩn được sử dụng trong vòng 2 tháng kể từ khi chuẩn bị, không có sự giảm đáng kể nào về phản ứng và độ dốc ổn định trong tất cả các lần chạy phân tích. Chiết xuất mẫu và Phân tách sắc ký Đối với việc chiết xuất mẫu, 100µL plasma được nạp trực tiếp vào cột ISOLUTE PLD+ theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, 5µL của hỗn hợp chuẩn nội địa (1000ng/mL hỗn hợp axit mật đánh dấu lạnh ổn định) được thêm vào mỗi ống. Các mẫu sau đó được tăng cường với 400µL acetonitrile và lắc đều trong vòng 30 giây để kết tủa protein. Dòng chảy mẫu được thu thập dưới áp suất dương, và dung dịch được làm khô dưới dòng nitơ ở 40°C. Các mẫu được phục hồi bằng hỗn hợp 50:50 nước/acetonitrile chứa 0.01% axit fomic. Cuối cùng, các mẫu được chuyển sang ống mẫu tự động thủy tinh với các chiếc chèn hình nón để tiến hành phân tích sau này. Thông số phân tích LC-MS/MS Phân tích LC-MS/MS được thực hiện bằng hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu suất Waters I-Class kết hợp với máy quang phổ khối Waters TQ-XS tandem quadrupole. Quá trình phân tách sắc ký được thực hiện bằng cách sử dụng 0.01% axit fomic trong nước làm pha động A và 0.01% axit fomic trong acetonitrile làm pha động B, với nhiệt độ cột được đặt ở 55°C. Cột cụ thể được sử dụng là Acquity BEH C18 (150×2.1mm, 1.7µm). Chương trình gradient kéo dài 32 phút, bắt đầu với 25% B và dần tăng lên 100% B. Đáng chú ý, quá trình rửa kim mũi mạnh đã được thay đổi để giảm tải từ axit mật có gốc taurine. 3µL của mỗi mẫu được tiêm cho phân tích. Phân tích phổ khối phổ và Xử lý dữ liệu Phân tích phổ khối phổ tiếp theo được thực hiện ở chế độ ion âm ESI do tính axit của axit mật. Các thông số được sử dụng cho phân tích bao gồm điện áp cực 2.5kV, nhiệt độ khử nước 500°C, lưu lượng khử nước 800L/giờ, lưu lượng côn 150L/giờ, áp suất phun 7Bar, lưu lượng khí va chạm 0.15mL/phút và nhiệt độ nguồn 150°C. Ba khoảng thời gian được lên lịch để theo dõi quá trình elution từ cột, mỗi khoảng thời gian được dành cho các nhóm axit mật khác nhau. Chuyển đổi khối lượng, điện áp côn và năng lượng va chạm đã được tối ưu hóa cẩn thận cho mỗi axit mật để đảm bảo định lượng chính xác. Xác nhận và phân tích dữ liệu Các loạt mẫu được coi là chấp nhận được dựa trên các tiêu chí nghiêm ngặt được nêu trong Hướng dẫn của FDA về Xác nhận Phương pháp Sinh học. Dữ liệu được thu thập bằng cách sử dụng MassLynx (v 4.1), trong khi việc hồi quy chuẩn được thực hiện bằng cách sử dụng TargetLynx (v 4.1). Đáng chú ý, phương pháp phân tích sử dụng trọng số tuyến tính 1/x2 cho hầu hết các chất phân tích, ngoại trừ UDCA, cho đó sử dụng trọng số bậc hai 1/y2, như được đề xuất bởi Gu et al. (34). Diện tích dưới đường cong (AUC) được tính toán giữa 0 và 10 giờ bằng quy tắc hình thang, cung cấp một độ đo đáng tin cậy về nồng độ axit mật trong các mẫu. Tóm lại, việc định lượng chính xác axit chenodeoxycholic và các axit mật tự nhiên khác là rất quan trọng để hiểu rõ vai trò của chúng trong nhiều quá trình sinh lý và trong tình trạng bệnh lý. Phương pháp mô tả trong bài viết này cung cấp một phương pháp phân tích mạnh mẽ và đáng tin cậy, cho phép đo lường chính xác nồng độ axit mật trong các mẫu sinh học. Phương pháp này là một công cụ quý giá cho các nhà nghiên cứu và bác sĩ lâm sàng nhằm khám phá các quy luật phức tạp của quá trình chuyển hóa axit mật và tác động của chúng đối với sức khỏe và bệnh tật.

Định lượng axit chenodeoxycholic và axit mật tự nhiên: Một phương pháp phân tích toàn diện

Axit mật đóng vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa và hấp thụ chất béo từ thức ăn cũng như vitamin tan trong chất béo. Việc định lượng các axit mật này là cực kỳ quan trọng để hiểu về vai trò của chúng trong các quá trình sinh lý cũng như tác động của chúng đối với nhiều tình trạng bệnh lý khác nhau. Bài viết này trình bày chi tiết về phương pháp định lượng axit chenodeoxycholic (CDCA) và các axit mật tự nhiên khác bằng cách sử dụng phương pháp LC-MS/MS đã được thiết lập tốt với những điều chỉnh nhỏ.

Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu này dựa trên phương pháp đã được công bố trước đó, với các điều chỉnh được tinh chỉnh để tăng độ chính xác và độ nhạy. Dưới đây là các bước chi tiết trong quá trình định lượng axit mật, bao gồm việc chuẩn bị dung dịch chuẩn, chiết xuất mẫu, phân tách sắc ký, phân tích khối lượng qua phổ khối phổ, và xử lý dữ liệu.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn và chuẩn hiệu chỉnh

Bước đầu tiên trong quá trình định lượng là chuẩn bị các dung dịch chuẩn của các vật liệu tham chiếu. Mỗi axit mật đã được cân và hòa tan riêng lẻ trong methanol, lấy vào cân nhắc đến hình thức muối và độ tinh khiết được chỉ định trong chứng chỉ phân tích. Các dung dịch chuẩn này được lưu trữ ở nhiệt độ -20°C trong suốt thời gian nghiên cứu. Các mẫu chuẩn hiệu chỉnh mới được chuẩn bị kỹ lưỡng ở chín nồng độ khác nhau từ 1 đến 1000 ng/mL cho mỗi loạt phân tích. Ngoài ra, các mẫu kiểm soát chất lượng ở ba nồng độ (15, 400 và 800 ng/mL) cũng được bao gồm để đảm bảo tính đáng tin cậy của phương pháp phân tích. Đáng chú ý rằng tất cả các dung dịch chuẩn được sử dụng trong vòng 2 tháng kể từ khi chuẩn bị, không có sự giảm đáng kể nào về phản ứng và độ dốc ổn định trong tất cả các lần chạy phân tích.

Chiết xuất mẫu và Phân tách sắc ký

Đối với việc chiết xuất mẫu, 100µL plasma được nạp trực tiếp vào cột ISOLUTE PLD+ theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, 5µL của hỗn hợp chuẩn nội địa (1000ng/mL hỗn hợp axit mật đánh dấu lạnh ổn định) được thêm vào mỗi ống. Các mẫu sau đó được tăng cường với 400µL acetonitrile và lắc đều trong vòng 30 giây để kết tủa protein. Dòng chảy mẫu được thu thập dưới áp suất dương, và dung dịch được làm khô dưới dòng nitơ ở 40°C. Các mẫu được phục hồi bằng hỗn hợp 50:50 nước/acetonitrile chứa 0.01% axit fomic. Cuối cùng, các mẫu được chuyển sang ống mẫu tự động thủy tinh với các chiếc chèn hình nón để tiến hành phân tích sau này.

Thông số phân tích LC-MS/MS

Phân tích LC-MS/MS được thực hiện bằng hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu suất Waters I-Class kết hợp với máy quang phổ khối Waters TQ-XS tandem quadrupole. Quá trình phân tách sắc ký được thực hiện bằng cách sử dụng 0.01% axit fomic trong nước làm pha động A và 0.01% axit fomic trong acetonitrile làm pha động B, với nhiệt độ cột được đặt ở 55°C. Cột cụ thể được sử dụng là Acquity BEH C18 (150×2.1mm, 1.7µm). Chương trình gradient kéo dài 32 phút, bắt đầu với 25% B và dần tăng lên 100% B. Đáng chú ý, quá trình rửa kim mũi mạnh đã được thay đổi để giảm tải từ axit mật có gốc taurine. 3µL của mỗi mẫu được tiêm cho phân tích.

Phân tích phổ khối phổ và Xử lý dữ liệu

Phân tích phổ khối phổ tiếp theo được thực hiện ở chế độ ion âm ESI do tính axit của axit mật. Các thông số được sử dụng cho phân tích bao gồm điện áp cực 2.5kV, nhiệt độ khử nước 500°C, lưu lượng khử nước 800L/giờ, lưu lượng côn 150L/giờ, áp suất phun 7Bar, lưu lượng khí va chạm 0.15mL/phút và nhiệt độ nguồn 150°C. Ba khoảng thời gian được lên lịch để theo dõi quá trình elution từ cột, mỗi khoảng thời gian được dành cho các nhóm axit mật khác nhau. Chuyển đổi khối lượng, điện áp côn và năng lượng va chạm đã được tối ưu hóa cẩn thận cho mỗi axit mật để đảm bảo định lượng chính xác.

Xác nhận và phân tích dữ liệu

Các loạt mẫu được coi là chấp nhận được dựa trên các tiêu chí nghiêm ngặt được nêu trong Hướng dẫn của FDA về Xác nhận Phương pháp Sinh học. Dữ liệu được thu thập bằng cách sử dụng MassLynx (v 4.1), trong khi việc hồi quy chuẩn được thực hiện bằng cách sử dụng TargetLynx (v 4.1). Đáng chú ý, phương pháp phân tích sử dụng trọng số tuyến tính 1/x2 cho hầu hết các chất phân tích, ngoại trừ UDCA, cho đó sử dụng trọng số bậc hai 1/y2, như được đề xuất bởi Gu et al. (34). Diện tích dưới đường cong (AUC) được tính toán giữa 0 và 10 giờ bằng quy tắc hình thang, cung cấp một độ đo đáng tin cậy về nồng độ axit mật trong các mẫu.

Tóm lại, việc định lượng chính xác axit chenodeoxycholic và các axit mật tự nhiên khác là rất quan trọng để hiểu rõ vai trò của chúng trong nhiều quá trình sinh lý và trong tình trạng bệnh lý. Phương pháp mô tả trong bài viết này cung cấp một phương pháp phân tích mạnh mẽ và đáng tin cậy, cho phép đo lường chính xác nồng độ axit mật trong các mẫu sinh học. Phương pháp này là một công cụ quý giá cho các nhà nghiên cứu và bác sĩ lâm sàng nhằm khám phá các quy luật phức tạp của quá trình chuyển hóa axit mật và tác động của chúng đối với sức khỏe và bệnh tật.