Bào chế hỗn dịch nano curcumin

Hỗn dịch nano được bào chế với công thức cơ bản cho 1 mẻ được trình bày ở bảng 2.4.

Bảng 2.4. Thành phần hỗn dịch nano curcumin mẻ 1 và 5 gam. Chất diện hoạt thể lỏng (Tween 80, Tween 60 hoặc Cremophor RH40)

Hỗn dịch nano curcumin được bào chế bằng phương pháp giảm kích thước tiểu phân sử dụng kỹ thuật nghiền bi kết hợp đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn theo sơ đồ hình 2.1.

Mô tả quy trình:

Quy trình A (áp dụng với mẻ 1 g)

Cân DC và tá dược theo tỷ lệ đã định.

Ngâm trương nở Na CMC hoặc hòa tan polyme (PVP hoặc PVA) trong 25 ml nước tạo dung dịch.

Nghiền mịn curcumin bằng thiết bị nghiền bi inox, kích thước bi 20 mm, mỗi mẻ 1 g trong một buồng nghiền, thời gian nghiền 60 phút ở tần số 25 Hz.

Phối hợp chất diện hoạt thể lỏng (Tween 80, Tween 60 hoặc Cremophor RH40) hoặc dung dịch chất diện hoạt Poloxame 188 hòa tan trong 1 ml dung dịch polyme ở trên và nghiền ướt tạo hỗn dịch đặc bằng chày cối, thời gian nghiền 15 phút.

Thêm từ từ dung dịch polyme để tạo hỗn dịch curcumin.

Đồng nhất hóa hỗn dịch nhờ lực phân cắt lớn với tốc độ 18000 vòng/phút trong thời gian 15 phút (có thể thay đổi phù hợp với điều kiện khảo sát) tạo hỗn dịch nano.

Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế hỗn dịch nano curcumin Quy trình B (áp dụng với mẻ 5 g)

Cân DC và tá dược theo tỷ lệ đã định.

Hòa tan polyme trong 10 ml nước nóng tạo dung dịch polyme.

Nghiền mịn curcumin bằng thiết bị nghiền bi inox, kích thước bi 20 mm, mỗi mẻ 5 g trong mỗi buồng nghiền, với tần số nghiền 15 hoặc 30 Hz và thời gian thay đổi từ 1 đến 6 giờ.

Phối hợp chất diện hoạt (Tween 80, Tween 60 hoặc Cremophor RH40) và dung dịch polyme, nghiền ướt bằng buồng nghiền chứa 25 g bi zirconi oxyd, kích thước bi 0,65 hoặc 0,8 mm, mỗi buồng nghiền chứa 5 g DC, tần số nghiền 15 hoặc 30 Hz trong thời gian thay đổi từ 1 đến 6 giờ.

Pha loãng hỗn dịch đặc bằng 100 ml nước tinh khiết. Lọc loại bi qua rây 300.

Đồng nhất hóa hỗn dịch nhờ lực phân cắt lớn với tốc độ 18000 vòng/phút trong thời gian 60 phút, cứ mỗi 15 phút lại cho máy nghỉ 5 phút. Tốc độ và thời gian đồng nhất có thể thay đổi phù hợp với khảo sát.

Bào chế hệ tiểu phân nano curcumin dạng bột phun sấy

Đối với mẻ 1 g, tiến hành phun sấy hỗn dịch nano thu được ở trên. Đối với mẻ 5 g, hòa tan chất mang thân nước vào 15 ml nước còn lại, phối hợp với hỗn dịch nano. Quá trình phun sấy được tiến hành với các thông số: nhiệt độ đầu vào 96oC, tốc độ cấp dịch 2 ml/phút và tỷ lệ thông gió 99% (có thể thay đổi phù hợp với điều kiện khảo sát). Hỗn dịch nano được khuấy từ liên tục trong thời gian phun sấy. Bột phun sấy được thu hồi trên cả cyclon và bộ phận thu hồi sản phẩm trong phòng kín với độ ẩm khoảng 30-40%. Bột phun sấy được đóng vào lọ thủy tinh, đậy nút cao su và chụp nắp nhôm. Các lọ thủy tinh được bọc kín, tránh ánh sáng và bảo quản trong bình hút ẩm.

Kiểm soát các thông số trong quá trình bào chế

Khi tiến hành nâng cấp quy mô bào chế từ 1 g lên 5 g/mẻ, các giai đoạn trọng yếu trong quy trình bào chế và các thông số trọng yếu trong từng giai đoạn cần được xác định. Các giai đoạn trọng yếu và thông số trọng yếu được liệt kê trong bảng 2.5. Bảng 2.5. Các giai đoạn trọng yếu và các thông số trọng yếu trong từng giai đoạn của quy trình bào chế bột phun sấy chứa nano curcumin

Nghiên cứu được tiến hành với 3 mẻ liên tiếp ở quy mô 5g/mẻ. Xác định các chỉ tiêu chất lượng trọng yếu cho từng giai đoạn trong quy trình bào chế và kế hoạch lấy mẫu được trình bày ở bảng 2.6.

Bảng 2.6. Kế hoạch lấy mẫu

Sơ đồ các vị trí lấy mẫu trong buồng nghiền của thiết bị nghiền bi và trong cốc khuấy được minh họa ở hình 2.2.

Hình 2.2. Sơ đồ vị trí lấy mẫu trong buồng nghiền bi và cốc khuấy

Vị trí lấy mẫu trong buồng nghiền vi trí lấy mẫu trong cốc khuấy đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn

Phương pháp đánh giá một số đặc tính của tiểu phân nano curcumin

Đánh giá hình thái và kích thước hệ tiểu phân nano bằng kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope-SEM)

Phân tán bột phun sấy chứa tiểu phân nano curcumin vào nước để tạo hỗn dịch nano. Hỗn dịch nano được ly tâm ở tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút để thu lấy kết tủa, rửa tủa 3 lần bằng nước tinh khiết, làm khô ở nhiệt độ 40-50oC và chụp SEM. Bột phun sấy chứa nano curcumin được chụp SEM trực tiếp. Cách tiến hành tương tự như đối với DC (mục 2.3.2.1.a).

Đánh giá kích thước tiểu phân trung bình và khoảng phân bố kích thước tiểu phân hoặc hệ số đa phân tán

Tiến hành đánh giá KTTP và khoảng phân bố KTTP (Span) của mẫu curcumin trong giai đoạn nghiền khô và nghiền ướt bằng thiết bị đo Mastersizer 3000E. Đối với mẫu nghiền khô, tiến hành phân tán trong môi trường nước chứa 0,1% tween polysorbate 80 tương tự như đối với DC (mục 2.3.2.1.b). Đối với mẫu nghiền ướt, tiến hành phân tán trong nước tinh khiết.

Hỗn dịch nano trước khi phun sấy và bột phun sấy chứa tiểu phân nano được tiến hành xác định kích thước và phân bố kích thước bằng thiết bị đo thế zeta và xác định phân bố KTTP Zetasizer Nano ZS90 Malvern. Nguyên tắc của thiết bị này dựa trên mức độ tán xạ ánh sáng khác nhau khi chiếu chùm tia laze vào các tiểu phân có kích thước khác nhau. Dựa vào mức độ tán xạ của chùm tia sau khi va chạm vào tiểu phân ta có thể tính được KTTP theo thuyết Mie.

Hỗn dịch nano hoặc bột phun sấy chứa tiểu phân nano được phân tán trong nước tinh khiết đến nồng độ DC sao cho tốc độ đếm tiểu phân khoảng 150-250 kcps. Hệ số tán xạ ánh sáng của curcumin là 1,42. Ánh sáng tán xạ được đo ở góc 90o.

Phương pháp xác định thế zeta

Thế zeta được xác định gián tiếp thông qua linh độ điện di của tiểu phân nano khi đặt trong điện trường. Tốc độ di chuyển của tiểu phân được xác định thông qua việc so sánh sự sai khác về pha giữa ánh sáng tán xạ và ánh sáng từ nguồn laze nhờ ứng dụng định luật Doppler. Hỗn dịch nano curcumin được pha loãng đến nồng độ tương tự như mẫu đo KTTP trước khi đưa vào máy đo, sử dụng thiết bị Zetasizer ZS90 Malvern với cuvet nhựa có 2 lá điện cực bằng đồng.

Đánh giá diện tích bề mặt và độ xốp, phổ nhiễu xạ tia X, giản đồ nhiệt vi sai và phổ hồng ngoại

Tiến hành tương tự như đối với nguyên liệu curcumin nhưng thay curcumin bằng bột phun sấy chứa nano curcumin (mục 2.3.2.1.c, d, e, f).

Mất khối lượng do làm khô

Mất khối lượng do làm khô được đánh giá bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 100oC, phụ lục 9.6, Dược điển Việt Nam IV . Cân khoảng 1 g bột phun sấy chứa nano curcumin và sử dụng cân xác định mất khối lượng do làm khô. Công thức tính phần trăm mất khối lượng do làm khô:

% mất khối lượng do làm khô = (m _bđ - m _s )/ m _bđ x 100%

Trong đó m_bđ: khối lượng bột phun sấy trước khi đánh giá

m_s : khối lượng bột phun sấy sau khi mất khối lượng do làm khô

Xác định khối lượng riêng biểu kiến

Xác định trên máy đo thể tích biểu kiến của hạt và bột Erweka SVM bằng cách gõ 30 lần. Khối lượng bột phun sấy chứa nano curcumin sử dụng cho mỗi lần đo là 5 g.

Khối lượng riêng biểu kiến được tính theo công thức sau:

d_bk = m/ V

Trong đó dbk: khối lượng riêng biểu kiến của bột (g/ml).

m : khối lượng bột phun sấy trong ống đong (g) .

V: thể tích biểu kiến của bột sau khi gõ (ml).

Hiệu suất của quá trình bào chế

Hiệu suất được đánh giá bằng tỷ lệ giữa khối lượng curcumin tương ứng với khối lượng sản phẩm thu được và khối lượng curcumin ban đầu:

H% = m_sp/m_bđ× 100%

Trong đó m_sp: khối lượng curcumin tương ứng có trong khối lượng sản phẩm (g)

m_bđ: khối lượng curcumin ban đầu (g)

Phương pháp định lượng curcumin trong các mẫu nghiên cứu

Hàm lượng curcumin trong các mẫu nghiên cứu được định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis hoặc HPLC.

Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis

Cách tiến hành tương tự như mục 2.3.1.1 nhưng dung dịch thử được chuẩn bị bằng cách thay curcumin chuẩn bằng một lượng bột phun sấy chứa nano curcumin tương ứng với 10,0 mg curcumin. Hàm lượng curcumin trong bột phun sấy chứa nano curcumin được tính toán theo công thức:

% CUR = (D_t / D_c )x (m_c/m) x 100%

Trong đó D_T,: độ hấp thụ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn.

m_c : khối lượng curcumin chuẩn (mg)

m : khối lượng bột phun sấy chứa nano curcumin (mg)

Mỗi mẫu thử làm 3 lần lấy kết quả trung bình.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chuẩn bị dung môi pha loãng, dung dịch chuẩn, dung dịch thử và tiến hành chạy sắc ký theo mục 2.3.1.2. Hàm lượng curcumin trong bột phun sấy chứa nano curcumin được tính toán theo công thức:

% CUR = (S_t /S_c )x (m_c /m) x 100%

Trong đó S_t, S_c: diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn (mAU.giây).

m_c : khối lượng curcumin chuẩn (mg)

m : khối lượng bột phun sấy chứa nano curcumin (mg)

Hàm lượng curcumin cũng có thể được tính toán theo phương trình hồi quy tuyến tính mô tả mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ curcumin xây dựng theo phương pháp ở mục 2.3.1.2. Mỗi mẫu thử làm 3 lần lấy kết quả trung bình.

Phương pháp đánh giá độ tan và độ hòa tan của curcumin trong các mẫu nghiên cứu

Tiến hành tương tự như đối với nguyên liệu curcumin nhưng thay bằng bột phun sấy chứa nano curcumin với khối lượng tương ứng (mục 2.3.2.1.h, 2.3.2.1.i).

Phương pháp thiết kế thí nghiệm, đánh giá ảnh hưởng của thành phần công thức, thông số quy trình và tối ưu hóa

Bố trí thí nghiệm

Sử dụng phần mềm MODDE 8.0 (Umetrics Inc., USA) để thiết kế thí nghiệm cổ điển một cách ngẫu nhiên dựa trên nguyên tắc hợp tử tại tâm.

Phân tích và tối ưu hóa

Ảnh hưởng của các biến đầu vào đến các biến đầu ra và công thức và một số thông số tối ưu trong quy trình được xác định dựa trên mô hình mạng neuron nhân tạo bằng phần mềm FormRules 2.0 và INForm 3.1 (Intelligensys Ltd., UK),.

Chỉ số biểu hiện sự giống nhau f2 theo quy định của FDA

Phương pháp phân tích thống kê

Các số liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (GTTB ± SD). Sự khác nhau giữa hai nhóm được đánh giá bằng kiểm định t-test. Sự khác nhau giữa các nhóm được đánh giá bằng phân tích ANOVA một chiều và phân tích post-hoc (kiểm định LSD) sử dụng phần mềm thống kê SPSS (IBM SPSS Statistics 20). Giá trị p < 0,05 được coi là có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê.